基于腫瘤免疫微環(huán)境的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后分析*

黃玉潔，黃鑫，郭寶平，柯晴，譚曉虹，岑洪

530021 南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 淋巴血液腫瘤科

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤亞型，具有較高的臨床和生物學(xué)異質(zhì)性。腫瘤細(xì)胞所處的腫瘤微環(huán)境(the tumor microenvironment，TME)由腫瘤細(xì)胞、多種間質(zhì)細(xì)胞(如免疫細(xì)胞)及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，對(duì)治療效果也有深遠(yuǎn)的影響。一般認(rèn)為DLBCL在腫瘤組織中可見(jiàn)彌漫性淋巴瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，正常的免疫細(xì)胞成分較少，屬于免疫冷腫瘤。免疫細(xì)胞在DLBCL發(fā)育過(guò)程中的作用是復(fù)雜的，涉及腫瘤細(xì)胞、適應(yīng)性和天然免疫細(xì)胞、可溶性介質(zhì)及TME中的結(jié)構(gòu)成分之間的相互作用。然而，隨著研究不斷深入，越來(lái)越多的證據(jù)表明，DLBCL腫瘤細(xì)胞與各種免疫細(xì)胞的交互作用對(duì)疾病的發(fā)展至關(guān)重要，這也增加了DLBCL亞型的復(fù)雜性。人們逐漸認(rèn)識(shí)到，淋巴瘤細(xì)胞與免疫微環(huán)境之間的交互作用被破壞，將會(huì)導(dǎo)致淋巴瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫監(jiān)視，使病情不斷進(jìn)展[1]。隨著基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)的普及，生物信息學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，目前已經(jīng)能夠分析淋巴瘤組織中各種免疫細(xì)胞的成分及各信號(hào)通路的活化情況。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)和數(shù)據(jù)挖掘的方法探討DLBCL免疫微環(huán)境對(duì)預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

所有數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載(網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，選取已公開(kāi)發(fā)表且基因表達(dá)譜和臨床生存信息完整的3個(gè)DLBCL患者數(shù)據(jù)集納入分析，即GSE10846、GSE31312和GSE98588，分別得到233、469和105例DLBCL樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理

用R語(yǔ)言程序(4.0.2版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用GSVA函數(shù)包對(duì)DLBCL患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行ssGSEA分析，得到每個(gè)DLBCL樣本在16條免疫相關(guān)信號(hào)通路的富集分?jǐn)?shù)(enrichment score, ES)；用xCell(https://xcell.ucsf.edu/)根據(jù)每種免疫細(xì)胞的標(biāo)記基因特征來(lái)量化每種細(xì)胞在腫瘤組織中的豐度，計(jì)算出27種人類免疫細(xì)胞類型在腫瘤組織中的浸潤(rùn)比例。用“survminer”函數(shù)R包批量計(jì)算樣本在16個(gè)免疫相關(guān)基因集富集分?jǐn)?shù)和27種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例的最佳截點(diǎn),分為高、低兩組，采用Kaplan-Meier法對(duì)兩組患者進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線。比較分析ABC亞型和GCB亞型兩組樣本中免疫相關(guān)信號(hào)通路的富集差異和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用R軟件(版本4.0.2)和相關(guān)R包進(jìn)行。分類數(shù)據(jù)采用n(%)表示。分類資料的組間比較采用t檢驗(yàn)。生存曲線分析采用 Kaplan-Meier，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以雙側(cè)P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 入組患者的臨床特征

本組患者來(lái)源于3個(gè)DLBCL數(shù)據(jù)集，其臨床特征見(jiàn)表1。

2.2 免疫相關(guān)信號(hào)通路與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)對(duì)3個(gè)DLBCL數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)，GSE98588數(shù)據(jù)集跟預(yù)后相關(guān)的免疫信號(hào)通路有13條，GSE31312數(shù)據(jù)集跟預(yù)后相關(guān)的信號(hào)通路有16條，GSE10846數(shù)據(jù)集跟預(yù)后相關(guān)的信號(hào)通路有9條；三個(gè)數(shù)據(jù)集中跟預(yù)后相關(guān)的共同通路有以下8條(圖1、2)：適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通路、淋巴細(xì)胞活化通路、MHC Ⅱ類抗原呈遞信號(hào)通路、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、Ⅱ型干擾素信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞黏附信號(hào)通路；這些通路富集分?jǐn)?shù)高的患者預(yù)后更好，提示這些免疫相關(guān)信號(hào)通路的活化能激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，改善預(yù)后。

表1 入組患者的臨床特征

2.3 免疫相關(guān)通路在ABC亞型和GCB亞型樣本的GSEA分析

分別對(duì)3個(gè)DLBCL數(shù)據(jù)集基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA富集分析，觀察在3個(gè)數(shù)據(jù)集中均有預(yù)后意義的8條免疫相關(guān)信號(hào)通路在ABC、GCB亞型中的富集情況，發(fā)現(xiàn)GSE98588富集到有差異(P<0.05)的通路有2條，GSE31312富集到有差異(P<0.05)的通路有3條，GSE10846富集到有差異(P<0.05)的通路有2條(圖3)；3個(gè)數(shù)據(jù)集富集分析結(jié)果顯示，I型干擾素信號(hào)通路均在GCB亞型中顯著富集(P<0.05)，該通路涉及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活化和殺傷，提示GCB亞型比ABC亞型有更強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖1 免疫信號(hào)通路的富集程度與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 GSE10846、GSE98588、GSE31312數(shù)據(jù)集中與預(yù)后相關(guān)的通路韋恩圖

2.4 腫瘤組織中免疫細(xì)胞亞群與預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)對(duì)3個(gè)DLBCL數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn)，GSE98588數(shù)據(jù)集中與預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群有16個(gè)，GSE31312數(shù)據(jù)集跟預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群有19個(gè)，GSE10846數(shù)據(jù)集跟預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群有15個(gè)；3個(gè)數(shù)據(jù)集中跟預(yù)后相關(guān)的相同免疫細(xì)胞亞群有10個(gè)(圖4、5):CD4+T淋巴細(xì)胞、CD4+效應(yīng)記憶T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、Th1細(xì)胞、活化樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)程度高者預(yù)后較好；嗜酸性粒細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞浸潤(rùn)程度高者則預(yù)后不良。

圖3 免疫相關(guān)信號(hào)通路在ABC-DLBCL和GCB-DLBCL的GSEA分析

圖4 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系

圖5 GSE10846、GSE98588、GSE31312數(shù)據(jù)集中與預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞的韋恩圖

2.5 比較ABC亞型和GCB亞型DLBCL免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的差異

分析在3個(gè)數(shù)據(jù)集中均有預(yù)后意義的10個(gè)免疫細(xì)胞亞群，觀察其在ABC、GCB亞型患者中的浸潤(rùn)比例有無(wú)差異。結(jié)果顯示GSE98588數(shù)據(jù)集有差異(P<0.05)的細(xì)胞亞群有 1個(gè)，GSE31312數(shù)據(jù)集有 3個(gè)，GSE10846數(shù)據(jù)集有 4個(gè)(表2)。3個(gè)數(shù)據(jù)集免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度差異分析結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞在ABC亞型的浸潤(rùn)程度均顯著高于GCB亞型(圖6)，提示該細(xì)胞浸潤(rùn)程度高可能是ABC型DLBCL預(yù)后不佳的原因之一。

圖6 ABC亞型和GCB亞型中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)比例的差異分析

3 討 論

目前臨床上常根據(jù)淋巴瘤細(xì)胞起源、淋巴瘤細(xì)胞基因變異分析等進(jìn)行DCBCL患者的預(yù)后評(píng)估，這些方法主要考慮的是腫瘤細(xì)胞的特征，而忽略了TME中免疫組分(包括細(xì)胞和細(xì)胞因子)的作用，未考慮免疫系統(tǒng)對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的影響。既往關(guān)于DLBCL免疫微環(huán)境的研究大都是基于免疫組化技術(shù)，分析腫瘤組織中各種細(xì)胞成分的比例及其浸潤(rùn)模式，且研究的細(xì)胞亞群有限，且研究結(jié)論不一致。Kusano等[2]發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)程度低的DLBCL患者總生存率較低，而這些細(xì)胞是以CD4+/CD45 RO1表型為特征的記憶T細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞淋巴瘤中激活的記憶CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)面積的增加與細(xì)胞增殖率的降低相關(guān)。另一項(xiàng)研究則表明DLBCL的微環(huán)境中高水平的PD-1和FoxP3+細(xì)胞群以及CD4+T細(xì)胞總數(shù)與臨床結(jié)果的改善相關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM，M2細(xì)胞)是DLBCL的預(yù)后不良因素[4-5]，但另一些研究未能得出同樣的結(jié)論[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)外周血中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例增高是DLBCL預(yù)后不良因素[7-8]，而成熟的DC細(xì)胞在淋巴瘤組織中的比例增高是DLBCL預(yù)后良好的因素[9-10]。

近幾年，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤臨床治療中取得了巨大成功，腫瘤與宿主免疫反應(yīng)之間存在持續(xù)的相互作用并決定腫瘤發(fā)展的觀點(diǎn)已被廣泛接受。腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤預(yù)后評(píng)估和治療中的重要性成為目前關(guān)注的重點(diǎn)。但腫瘤免疫微環(huán)境非常復(fù)雜，涉及的免疫細(xì)胞種類繁多，還受到微環(huán)境中各種細(xì)胞因子的影響。僅研究單一細(xì)胞或單一細(xì)胞因子難以觀察到腫瘤免疫微環(huán)境的全貌。隨著基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)的普及與生物信息學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步，目前人們已經(jīng)能夠分析淋巴瘤組織中各種免疫細(xì)胞的成分及各信號(hào)通路的活化情況。本研究分析了影響DLBCL發(fā)展的免疫決定因素，包括關(guān)鍵的免疫細(xì)胞類型和細(xì)胞免疫相關(guān)的信號(hào)通路，評(píng)估其預(yù)后價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，多種免疫細(xì)胞亞群和多條免疫相關(guān)信號(hào)通路均與預(yù)后相關(guān)，三個(gè)數(shù)據(jù)集中跟預(yù)后都相關(guān)的通路有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)通路、淋巴細(xì)胞活化通路、MHC II類抗原呈遞信號(hào)通路、I型干擾素信號(hào)通路、II型干擾素信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞黏附信號(hào)通路，這些通路都跟抗原遞呈、免疫細(xì)胞的活化和殺傷功能效應(yīng)相關(guān)，通路富集分?jǐn)?shù)高的患者預(yù)后更好，提示這些免疫相關(guān)信號(hào)通路的活化能激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，改善預(yù)后。3個(gè)數(shù)據(jù)集跟預(yù)后都相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群中，CD4+T淋巴細(xì)胞、CD4+效應(yīng)記憶T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、Th1細(xì)胞、活化樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)程度高者預(yù)后好，而嗜酸性粒細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞浸潤(rùn)程度高者預(yù)后不良。

CD4+T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)包括不同的細(xì)胞亞群(Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞等)，它們的預(yù)后意義不同。泛癌研究發(fā)現(xiàn)在大部分類型的腫瘤中，Th1細(xì)胞與預(yù)后良好密切相關(guān)[11-12]。其他T輔助細(xì)胞群(Th2、Th17和Treg細(xì)胞)對(duì)預(yù)后的影響取決于TME、癌癥類型和癌癥分期[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和CD4+記憶T細(xì)胞與生存期的延長(zhǎng)相關(guān)，這兩種細(xì)胞的預(yù)后意義已在不同腫瘤中得到證明[16]。DC是決定T細(xì)胞活化和分化的關(guān)鍵抗原遞呈細(xì)胞，活化的DC在多種腫瘤中的浸潤(rùn)增加與生存期的延長(zhǎng)有關(guān)[17-19]，本研究發(fā)現(xiàn)活化的DC是預(yù)后良好因素。巨噬細(xì)胞是組織駐留的分化單核細(xì)胞，具有吞噬活性，通常根據(jù)其分化狀態(tài)和功能作用分為M1和M2亞型。M1型巨噬細(xì)胞的特征在于其促炎特性，從而促進(jìn)了抗腫瘤Th1型反應(yīng);M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎性質(zhì)，并分泌IL-10，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和其他有助于建立耐受性微環(huán)境以及促血管生成因子的介質(zhì)[20]。M2細(xì)胞的高度浸潤(rùn)與乳腺癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤等腫瘤的生存期差有關(guān)[21-23]。本研究證實(shí)M2亞型是DLBCL預(yù)后不良因素。中性粒細(xì)胞是循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞，具有吞噬和抗菌能力。在涉及近4 000名腫瘤患者的薈萃分析中，證實(shí)腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞密度高與較差的生存率相關(guān)[24]，原因可能與腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞釋放出多種因子，發(fā)揮許多重要功能，包括腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)重塑，血管生成以及促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲有關(guān)[25]。

人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到腫瘤的免疫特征與預(yù)后相關(guān)，且能預(yù)測(cè)治療反應(yīng)。目前一些免疫細(xì)胞或因子的預(yù)測(cè)價(jià)值不一致可能是由于對(duì)這些細(xì)胞和因子的了解不夠，以及檢測(cè)的方法未標(biāo)準(zhǔn)化，需要對(duì)TME中多種免疫細(xì)胞更全面的理解。在不遠(yuǎn)的將來(lái)，患者的免疫特征也會(huì)納入DLBCL的分型中，指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫(xiě)的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測(cè)。

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書(shū)等協(xié)議。