非編碼RNA在神經內分泌前列腺癌中作用的研究進展

王 起，武士琪，吳開杰

(西安交通大學第一附屬醫院泌尿外科，陜西西安 710061)

前列腺癌是我國男性最常見的惡性腫瘤之一。神經內分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)是前列腺癌的一種特殊亞型，涵蓋從局灶具有NEPC細胞的前列腺腺癌(prostatic adenocarcinoma，PAC)到純小細胞神經內分泌癌的一系列表型。正常的前列腺組織主要包含管腔細胞、基底細胞和位于基底層的神經內分泌細胞(占1%)，參與前列腺上皮細胞的調節、分泌、分化和增殖[1]。原發性NEPC罕見(約0.5%～2%)，多數由PAC經神經內分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)而來，這被視為前列腺癌的一種適應性反應或耐藥機制。在特定條件下，腺癌細胞發生NED，通常表現為雄激素受體(androgen receptor,AR)表達降低，并表達NED標志物如突觸泡蛋白(synaptophysin,SYP)、嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A,CgA)及神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)等，成為NEPC細胞。雄激素阻斷治療(androgen deprivation therapy，ADT)特別是新型內分泌治療，例如恩雜魯胺(enzalutamide，Enz)等，可促進NED發生。此外，缺氧、細胞因子(例如IL-6)、生長因子、cAMP等均可在體外誘發NED。

NEPC具有高度侵襲性和轉移性，對激素治療不敏感，化療效果短暫，多數患者生存期少于1年，代表著前列腺癌的終末階段。同時，由于NEPC在病理標本的獲取上存在較大困難，通常依賴前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)反常的低水平和腫瘤轉移特征診斷，診斷效率低。因此，確定NEPC的分子機制，探索其診斷標志物及治療靶點，預防或延緩其發展是目前臨床診療的主要需求。近年來大量研究表明，非編碼RNA在細胞中具有重要的調控作用，尤其是在腫瘤的發生、進展、轉移和耐藥中扮演了關鍵的角色[2]。目前，在前列腺癌及NEPC發生發展中起調控作用的研究主要集中在microRNA(miR)、lncRNA及circRNA,本文將圍繞此3種非編碼RNA在NEPC中作用的最新進展予以綜述。

1 miR通過多種途徑參與NEPC調控

1.1 miR簡介miR是一類長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可與mRNA靶標的3’端非編碼區結合，通過抑制翻譯或降解靶mRNA來阻礙合成基因表達，抑制蛋白質的合成，在轉錄后的基因調控中發揮作用[3]。miR深度參與細胞增殖、凋亡、代謝等關鍵細胞功能[4]。目前，腫瘤miR譜被用來定義相關的疾病亞型、監測患者生存期和治療效果。在前列腺癌中，目前發現有數種miR能夠調節腫瘤的進展、上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和轉移[5]。在NEPC調控方面，miR可激活經神經內分泌基因，促進NED、癌癥轉移及腫瘤耐藥。

1.2 miR在NEPC中的調控作用

1.2.1雙重調控作用 對PAC細胞和體外誘導的NEPC細胞的微陣列分析顯示NED可造成mRNA和miR表達的廣泛改變，根據其調控靶點的不同，miR可作為致癌因子或抑制因子參與NEPC的生物學過程[3]。miR在NEPC發生發展的不同階段也存在雙重作用。細胞系和PDX模型中發現miR-204在PAC階段表現為腫瘤抑制因子，在NEPC中則起致癌作用，調控癌細胞生長和集落形成。實驗發現腺癌細胞中存在AR/miR-204/XRN1/miR-34a正反饋環，其在前列腺癌中作用的階段性差異主要依賴AR表達的改變：PAC階段AR高表達，雄激素可抑制miR-204表達從而上調XRN1，后者則通過靶向miR-34a來上調AR的表達，同時miR-34a還可抑制癌細胞中CD44的表達。ADT可導致AR表達下調，此時miR-204高表達不僅會通過反饋抑制AR，同時也可下調XRN1以促進CD44的表達。CD44的表達與AR陰性均為NEPC的細胞特征，說明miR-204可能參與并促進ADT誘導的NED[6]。

1.2.2調控NEPC生物學改變 在ADT誘導前列腺癌細胞休眠及復發的研究中，分別用LTL-313B和LTL-331模型模擬PAC發展到去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)和NEPC的臨床進展過程，并對這2個模型在去勢前、去勢后休眠、去勢后復發3個階段的全基因組miR表達譜分析，發現miR-100-5p在ADT壓力環境中上調，并參與癌細胞休眠和NED發生。在AR-細胞中，miR-100-5p可以通過下調pRb信號通路中的SMARCA5、BAZ2A和THAP2等來刺激快速增殖[4]。此外，通過二代測序發現miR-652的高表達也與前列腺癌的高復發率顯著相關。miR-652的過表達在PC3和LNCaP細胞系中導致腫瘤生長、遷移、侵襲性增加，在前列腺癌PDX模型中則表現出更高的致瘤性和轉移潛能。miR-652直接靶向腫瘤抑制物PP2A的β調節亞基PP2R3A，從而激活PI3K/AKT、ERK-1/2和Wnt通路，促進腫瘤生長和轉移，并誘導PC3細胞EMT和LNCaP細胞的NED。在過表達miR-652的PC3細胞中，間充質標記物N-鈣黏素增加而上皮標記E-鈣黏素減少；而過表達miR-652的LNCaP細胞和PDX模型中NE標志物明顯增加。EMT和NED在NEPC細胞中與AR通路抑制同時發生[7]，提示miR-652可能通過抑制PP2A功能，激活下游的通路，在PAC階段和NEPC階段發揮不同的調控作用，但均促進前列腺癌向NEPC進展[8]。

1.2.3參與調控NED的癌基因 擴增和抑癌基因的突變或缺失可導致PAC向NEPC進展，此前的研究證實MYCN和AURKA擴增、RB1及TP53缺失促使NEPC發生[9]。p53基因突變可導致前列腺癌細胞內miR-25的表達上調，后者可以抑制E3泛素連接酶Fbxw7，從而增加AUKRA的表達，促進小細胞神經內分泌癌(small cell neuroendocrine carcinoma,SCNC)的增殖和侵襲[10]。N-Myc在前列腺癌中過表達，YIN等[11]的研究發現N-myc在PAC階段和CRPC階段通過miR-421/ATM通路發揮不同作用，在PAC細胞中N-MYC的過表達通過上調miR-421抑制ATM，從而阻止ADT誘導的細胞凋亡，在CRPC階段miR-421受N-MYC和EZH2作用下調，其下游ATM表達增高，引起腫瘤遷移和侵襲性升高，并導致Enz耐藥。免疫與代謝失調是癌癥發生的關鍵因素之一，針對前列腺癌細胞募集肥大細胞的研究發現，浸潤的肥大細胞能夠靶向AR，一方面上調IL-8等趨化因子以正反饋促進PAC招募肥大細胞，另一方面升高miR-32在PAC中的表達，導致PAC細胞的形態改變和經神經內分泌標志物表達上調，促進NEPC發生。該研究同時證明Enz對AR的靶向作用亦可通過AR/IL-8和AR/miR-32通路分別促進肥大細胞募集和NEPC發生[12]。此外，較早的研究還發現miR-106b～25簇、miR-663、miR-221等可參與誘導PAC發生NED[8]。

2 lncRNA參與NEPC的生物學進程

2.1 lncRNA簡介長鏈非編碼RNA(lncRNA)定義為長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，與mRNA相比，lncRNA的表達水平較低，并具有更顯著的組織特異性[13]。近年來測序技術的進步推動著lncRNA的發現及其功能研究，lncRNA通過轉錄過程、轉錄后調節、表觀遺傳學[14]等機制在正常生長發育和疾病發生發展中發揮作用。lncRNA表達失調是驅動腫瘤發生發展的因素之一，因此被認為是具有潛力的癌癥生物標志物，在前列腺癌方面，美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批準1種lncRNA-前列腺癌抗原3作為臨床診療中新的診斷標志物[13]。lncRNA在NEPC生物學過程中的角色正在探索中。

2.2 lncRNA的調控作用

2.2.1表觀遺傳調控 新型抗雄激素藥Enz等對治療CRPC有效，但會促進NED的發生。lncRNA-p21是1種在PAC細胞系和NEPC細胞系中差異表達的lncRNA，通過在Enz/AR/lncRNA-p21/EZH2/STAT3軸中發揮正向調控作用，參與Enz誘導的NED。Enz可誘導lncRNA-p21在PAC及NEPC細胞系中顯著上調，伴隨神經內分泌標志物的表達升高。EZH2是表觀遺傳效應因子PRC2的核心單元，是1種組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶，一般通過甲基化H3K2改變下游不同靶基因表達[7]。lncRNA-p21可與EZH2結合，同時抑制EZH2與另一對PRC2有穩定作用的lncRNA-HOTAIR的結合，從而降低PRC2核心亞基間的相互作用、干擾PRC2形成，并增強EZH2的甲基轉移酶活性。實驗證明AKT可磷酸化EZH2并促進STAT3甲基化，而lncRNA-p21能夠作為AKT和EZH2的支架促進二者相互作用。此外，lncRNA-p21還能夠促進EZH2和STAT3相互作用。由此可見lncRNA-p21在該通路上發揮著多種功能，增強了STAT3的甲基化，誘導了NED發生[15]。如前所述，HOTAIR能夠與PRC2復合物相互作用，并參與隨后的生物學過程，這一功能與癌癥發展密切相關，能夠驅動CRPC的發展[16]。CHANG等[13]的研究認為HOTAIR通過多種機制參與了NED的發生。HOTAIR是神經元限制性沉默元件REST的下游靶向RNA，REST在NEPC中發揮核心作用。體外實驗證實HOTAIR在NE表型的CRPC細胞系中顯著上調，并與經神經內分泌標志物的表達提高同步，敲低HOTAIR基因可導致IL-6誘導的NED被抑制，由此推測HOTAIR參與調控IL-6誘導的NED過程。此外，對過表達HOTAIR的PAC細胞系和CRPC細胞系中失調基因的Go分析識別出了自噬途徑，且在HOTAIR過表達的LNCaP細胞中發現了自噬相關基因的表達上調。自噬在IL-6誘導的NED及NEPC的化療耐藥中具有關鍵作用[17]，說明HOTAIR可能在自噬途徑上對NEPC的發生發展具有調控作用。

2.2.2參與AR表達的調控 AR表達的降低是NEPC的經典特征，并被認為是腺癌細胞發生NED的重要因素之一。但部分研究發現治療誘導性NEPC細胞中可保留有AR表達[14,18]，提示表觀調控可能參與影響NEPC中的AR表達。lncRNA-LBCS高表達可恢復CRPC細胞對新型內分泌治療藥物(例如比卡魯胺)的敏感性，并與前列腺癌的良好預后相關。LBCs在CRPC中顯著下調，且其表達與AR表達及PSA水平呈負相關，機制研究發現LBCs能夠作為支架與RNA結合蛋白hnRNPK及AR mRNA相互作用，形成復合物，以此抑制AR表達。此外，其他lncRNA如HOTAIR和ARLNC1亦通過不同機制調控AR表達[19]。這些lncRNA對AR表達的調控并未證實與NEPC中AR的保留或喪失直接相關，但相關機制研究提示了非編碼RNA參與調控NEPC中AR表觀調控的可能性。

2.2.3腫瘤轉移和不良預后 CREA等[14]通過微陣列分析發現lncRNA-MIAT在NEPC細胞系中與SYP同時高表達。數據庫分析提示MIAT在前列腺癌轉移灶中顯著上調，并與Rb基因突變呈正相關。該研究認為MIAT可以與polycomb蛋白和Rb通路相互作用，同時研究還發現與MIAT正相關的基因涉及不良預后及轉移瘤形成，而雄激素依賴基因、胚胎干細胞沉默基因和HIF1靶基因等則與MIAT負相關，表明MIAT的上調與NEPC的多個分子生物學特征相關。

針對lncRNA的表達水平較低的問題，RAMNARINE等[20]運用改良的二代測序技術提高了對低表達轉錄產物的敏感性，并建立了關于lncRNA的全基因組目錄，將此應用于927個臨床樣本和LTL331模型，在NEPC中識別出了821種lncRNA，有121種在NEPC中顯著差異，并篩選出表達量最高幾種lncRNA，包括H19和LINC00617，以及與預后不良相關的LINC00514和SSTR5-AS1以及與轉移相關的FENDRR。

3 circRNA是NEPC的潛在調節因子

3.1 circRNA簡介circRNA是一類具有共價閉環結構的非編碼RNA，廣泛存在于各種組織和器官中。與線性RNA不同，circRNA的3’端和5’端連接在一起形成閉環結構，能夠抵抗外切核糖核酸酶的降解，具有高度的穩定性和保守性。circRNA在生物體具有多種功能，包括分子海綿作用、順式基因調控作用、通過競爭關系調控線性RNA的生成、參與蛋白質的翻譯、作為自噬調節劑等[21]。circRNA廣泛參與包括癌癥在內的各種疾病的發生和發展，其數量及功能可影響惡性腫瘤的發生、生長、侵襲、轉移、凋亡和血管生成等生物學過程，測序技術的更新發展使其展現出成為各類惡性腫瘤新的生物標志物或治療靶點的潛力。circRNA在NEPC的發生和進展中的作用尚缺乏針對性的研究證據，但其對PAC的調控功能已有研究支持。

3.2 circRNA調控前列腺癌的侵襲和遷移circRNA可作為miRNA的分子海綿，通過競爭性結合miRNA的結合位點來調控miRNA的活性[2]，這是circRNA在癌癥發生發展中最重要的機制之一，相關實驗研究了該機制在不同系統腫瘤中的調控作用。最近的一項研究通過circRNA陣列分析發現，circABCC4在前列腺癌組織中表達上調，并與患者預后不良相關。circABCC4可作為miR-1182的內源競爭性RNA，通過分子海綿作用抑制miR-1182的表達來增加FOXP4的表達，導致前列腺癌的進展[22]。其他類似的研究報道了circITCH[23]、circMYLK[24]、circFOXO3[25]等多個circRNA通過對靶向miRNA的分子海綿作用參與調控前列腺癌的生物學過程。此外，circKATNAL1雖然對miR-145-3p具有分子海綿作用，但其促進了miR-145-3p表達并抑制了下游靶基因表達[26]，展現了1種新的調控機制。值得一提的是，部分circRNA在PC3細胞系與LNCap細胞系中存在表達差異，并與癌細胞的增殖、遷移和侵襲相關。PC3為典型前列腺NEPC細胞，分化程度低、不含有內源性的雄激素受體，常用于CRPC和NEPC的研究。同時，多種circRNA都在前列腺癌的侵襲和轉移調控中發揮作用，而侵襲性和轉移潛能升高是NEPC的顯著特征，這些表現可能提示circRNA在NEPC發生發展中具有潛在的生物學功能。

此外，一項研究識別了4種AR來源的circRNA-circARs，這些circARs受雄激素抑制，在CRPC中顯著上調，并在CRPC的Enz耐藥進展過程中表達水平呈上升趨勢[27]，提示circRNA可能參與NEPC的部分生物學過程，具備成為NEPC生物標志物和治療靶點的潛力。

4 討論與展望

NEPC是前列腺癌致命的終末階段，但由于其AR非敏感性、低PSA表達、病理組織獲取困難，晚期患者較少行穿刺診斷等原因，NEPC的診斷、監測和治療面臨瓶頸。測序技術的發展和生物學研究推進了非編碼RNA及其生物學功能的發現。圖1概括了非編碼RNA從多方面參與對NEPC發生、發展的調控。此前也有文章討論了NEPC的生物學改變、遺傳學改變、表觀遺傳調控、轉錄調控及腫瘤微環境影響[7]，非編碼RNA恰恰廣泛參與到了這些分子生物學機制中，調控NEPC的發生發展。對這些作用機制的探究有助于推動NEPC診療方式的改進，并有希望提供新的診斷標志物或治療靶點，以提升對這種高度惡性疾病的應對策略。

圖1 非編碼RNA參與NEPC發生、發展的示意圖