林蛙油凍干粉抗疲勞、抗衰老藥理作用研究

李孟，呂邵娃，管慶霞，劉艷，楊大宇，楊炳友*，張鳳春，劉志茹，李永吉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江四寶生物科技股份有限公司，黑龍江 鐵力 152500)

林蛙油為雌性林蛙輸卵管的干制品，其主要成分包括蛋白質(zhì)、固醇和磷脂，有著極高的藥用價(jià)值[1-2]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)林蛙油具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、減輕疲勞等多種生物學(xué)作用[3-6]。為使林蛙油易于保管和貯藏，便于服用，將其經(jīng)冷凍干燥制成粉末，但林蛙油凍干粉上述功效是否能與新鮮林蛙油保持一致仍有待研究。本文以林蛙油凍干粉為研究對(duì)象，綜合比較林蛙油凍干粉與林蛙油的抗疲勞、抗衰老藥理作用，為今后開(kāi)發(fā)林蛙油產(chǎn)品及進(jìn)一步市場(chǎng)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD品系大鼠，體質(zhì)量(180±20)g。青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK(魯)20140001。

1.2 藥物與試劑

林蛙油凍干粉(黑龍江四寶生物科技股份有限公司提供，批號(hào)：20171101)；貞芪扶正顆粒(修正藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：170020)；血清睪酮試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H090)；血清皮質(zhì)酮試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H205)；尿素氮試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：C013-2)；糖原試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A043)；CAT試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A007-1-1)；MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A003-1)；NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A013-2)；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A001-3)；GR試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A062)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

101A-1E型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；FA2004分析電子天平(上海良平儀器儀表)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；VICTOR X3酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司)；TDL-4型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安享科學(xué)儀器廠)；108 mL手動(dòng)組織勻漿器(天津玻璃儀器廠)；H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.4 分組與處理方法

取雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃，相對(duì)濕度55%～75%，光照時(shí)間隨自然變化。大鼠均以基礎(chǔ)飼料和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食，實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以20 min的運(yùn)動(dòng)量對(duì)其進(jìn)行篩選，淘汰不適應(yīng)游泳訓(xùn)練的大鼠，將剩余56只大鼠按照隨機(jī)分組法分為7組：①靜止對(duì)照組：大鼠生理鹽水灌胃1 mL/d，每日1次；②運(yùn)動(dòng)對(duì)照組：大鼠生理鹽水灌胃1 mL/d，每日1次；③林蛙油凍干粉低劑量干預(yù)組：以0.05 g/kg濃度林蛙油凍干粉混懸液腹腔注射，每日1次；④林蛙油凍干粉中劑量干預(yù)組：以0.10 g/kg濃度林蛙油凍干粉混懸液腹腔注射，每日1次；⑤林蛙油凍干粉高劑量干預(yù)組：以0.20 g/kg濃度林蛙油凍干粉混懸液腹腔注射，每日1次；⑥林蛙油組：以0.10 g/kg濃度林蛙油混懸液腹腔注射，每日1次；⑦貞芪扶正顆粒組：貞芪扶正顆粒以0.30 g/kg濃度配置后腹腔注射，每日1次。各組連續(xù)干預(yù)30 d，于末次給藥60 min后進(jìn)行負(fù)重5%游泳力竭實(shí)驗(yàn)(靜止對(duì)照組除外)，測(cè)定大鼠體質(zhì)量變化和力竭時(shí)間，隨后麻醉，取腹主動(dòng)脈血測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。大鼠處死前12 h禁水禁食。

1.5 5%游泳力竭實(shí)驗(yàn)

采用100 cm×50 cm×60 cm的玻璃泳槽作為大鼠游泳訓(xùn)練裝置，水深50 cm。水溫(31±2)℃。為防止大鼠在水面漂浮不動(dòng)，特在游泳箱底部放置佳寶“AP1500”型水泵形成流動(dòng)水，使大鼠游泳至力竭。大鼠開(kāi)始游泳至力竭所用時(shí)間為力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10 s不露出水面為度，記錄力竭時(shí)的游泳時(shí)間。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

在大鼠游泳力竭測(cè)試后24 h稱體質(zhì)量，水合氯醛適度麻醉，從腹主動(dòng)脈處取血，4 ℃，3 000 r/min離心，分離制備血清。用試劑盒檢測(cè)大鼠血清睪酮、皮質(zhì)酮、BUN、肝糖原、肌糖原、NO、MDA、SOD、GR、CAT等指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及力竭時(shí)間測(cè)試

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組的體質(zhì)量與靜止對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。林蛙油凍干粉各給藥組分別與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，體質(zhì)量升高、力竭時(shí)間延長(zhǎng)，具有極顯著性(P<0.01)。在相同劑量下林蛙油凍干粉與林蛙油組相比，無(wú)顯著性差異,見(jiàn)表1。

表1 林蛙油凍干粉對(duì)大鼠體質(zhì)量及力竭時(shí)間的影響

2.2 對(duì)大鼠血清睪酮、皮質(zhì)酮的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組與靜止對(duì)照組相比，血清睪酮含量下降、睪酮/皮質(zhì)酮數(shù)值降低，且具有極顯著性(P<0.01)。林蛙油凍干粉中、高劑量給藥組與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，均能增加血清睪酮含量、睪酮/皮質(zhì)酮比值(P<0.05或P<0.01)。相同劑量下的林蛙油凍干粉與林蛙原油組相比，林蛙油組抗疲勞作用更加明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 林蛙油凍干粉對(duì)大鼠血清睪酮、皮質(zhì)酮的影響

2.3 對(duì)大鼠尿素氮(BUN)和肝、肌糖原儲(chǔ)量的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組與靜止對(duì)照組比較，BUN含量升高，肝糖原含量降低，肌糖原含量降低，且具有極顯著性(P<0.01)。林蛙油凍干粉中劑量組與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，前者使BUN含量降低且具有顯著性(P<0.05)。且在相同劑量下林蛙油凍干粉與林蛙油組相比，干預(yù)組的抗疲勞的作用更加明顯(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 林蛙油凍干粉對(duì)大鼠BUN和肝、肌糖原含量的影響

2.4 對(duì)大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT活力的影響

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組與靜止對(duì)照組相比， NO含量、MDA含量升高，SOD含量、GR含量、CAT含量降低，且具有極顯著性差異(P<0.01)。林蛙油各給藥組與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，NO含量降低且具有極顯著性差異(P<0.01)；MDA含量降低，SOD含量、GR含量、CAT含量明顯升高，具有極顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 林蛙油凍干粉對(duì)大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT活力的影響

3 討論

近年來(lái)通過(guò)對(duì)林蛙油研究發(fā)現(xiàn)其可以增加機(jī)體肝糖原儲(chǔ)量，提高運(yùn)動(dòng)耐力，改善物質(zhì)能量代謝，幫助降低血液中乳酸含量，即能減慢疲勞的產(chǎn)生速度同時(shí)又能幫助快速消除疲勞，又有一定的抗疲勞功效[7]。同時(shí)研究也表明[8]，林蛙油能明顯降低血液中丙二醛含量，提高谷胱甘肽過(guò)氧化酶活性，同時(shí)清除自由基，表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗衰老的藥理作用。研究采用貞芪扶正顆粒對(duì)照，貞芪扶正顆粒由黃芪、女貞子組成。黃芪能夠補(bǔ)氣固表，能夠調(diào)節(jié)虛勞諸證；女貞子能夠補(bǔ)肝益腎，《草本備要》中言其 “益肝腎，安五臟，強(qiáng)腰膝，明耳目，烏須發(fā)，補(bǔ)風(fēng)虛，除百病”，兩藥合用能夠扶正益氣。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芪多糖能夠提高小鼠免疫功能；女貞子多糖可以提高小鼠的非特異性細(xì)胞的免疫功能，同時(shí)具有延緩機(jī)體衰老的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)[9]，貞芪扶正顆粒能夠提高機(jī)體的免疫功能并保護(hù)腎上腺皮質(zhì)和骨髓功能，幫助機(jī)體調(diào)節(jié)身體平衡狀態(tài)，治療多種疾病引起的機(jī)體虛損狀態(tài)。

睪酮作為人體內(nèi)重要的促合成激素，可以刺激組織攝取氨基酸，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)肌纖維和骨骼的生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫力抵抗疲勞，從而增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力[10]。而皮質(zhì)醇作為促分解激素可減少蛋白質(zhì)合成、降低運(yùn)動(dòng)能力。睪酮與皮質(zhì)醇比值可衡量合成代謝的穩(wěn)定情況，進(jìn)而反映運(yùn)動(dòng)能力以及疲勞程度[11]。

BUN指血漿中除蛋白質(zhì)以外的一種含氮化合物，它從腎小球?yàn)V過(guò)而排出體外。在腎功能不全失代償時(shí)，BUN將升高，所以臨床以將其作為判斷腎小球?yàn)V過(guò)功能的指標(biāo)[12]。BUN過(guò)高會(huì)引發(fā)腎功能障礙，也是評(píng)價(jià)機(jī)體承受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷能力的重要指標(biāo)之一。肌糖原是骨骼肌中重要的能量來(lái)源，其貯備量與運(yùn)動(dòng)的耐力呈正相關(guān)。肝糖原則主要用于維持血糖的相對(duì)穩(wěn)定。肝糖原耗竭，血糖水平下降，會(huì)使運(yùn)動(dòng)肌和中樞神經(jīng)供能不足，導(dǎo)致外周和中樞疲勞。所以增加肝、肌糖原儲(chǔ)備，減少糖損耗，是延緩疲勞發(fā)生的重要措施[13]。

NO攜帶一個(gè)未配對(duì)電子，在體內(nèi)極不穩(wěn)定，這一特性恰好和其它游離自由基一樣，這樣兩者就非常容易結(jié)合產(chǎn)生反應(yīng)，從而使體內(nèi)自由基數(shù)量大大減少。衰老或其它疾病大都與過(guò)量自由基的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)，NO含量的降低可以起到抗氧化的作用。丙二醛是氧自由基氧化細(xì)胞膜上磷脂形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物的穩(wěn)定存在形式，可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，不斷地補(bǔ)充SOD，具有抗衰老的特殊效果。GR催化機(jī)體內(nèi)氧化型谷胱甘肽還原成谷胱甘肽，谷胱甘肽能和氧自由基結(jié)合，清除機(jī)體內(nèi)部的氧合自由基，以減少自由基對(duì)機(jī)體的損害。CAT存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過(guò)氧化體中，它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用[14]。

本研究目的探究林蛙油冷凍干燥后制成的粉末林蛙凍干粉治療效果，通過(guò)不同劑量林蛙油凍干粉與貞芪扶正顆粒進(jìn)行對(duì)比研究，同時(shí)以血清睪酮、皮質(zhì)醇、BUN等為綜合指標(biāo)，考察了林蛙油凍干粉對(duì)大鼠抗疲勞、抗衰老藥理作用的影響。結(jié)果顯示林蛙油凍干粉0.20 g/kg組的大鼠相比其他組體質(zhì)量升高、力竭時(shí)間延長(zhǎng)程度更優(yōu)，提示該濃度下的大鼠抗疲勞程度更強(qiáng)。此外，通過(guò)對(duì)比各組血清睪酮、皮質(zhì)酮的影響作用，發(fā)現(xiàn)高劑量的凍干粉組增加更為明顯，提示該組大鼠運(yùn)動(dòng)能力以及疲勞程度更強(qiáng)。對(duì)比各組大鼠尿素氮(BUN)和肝、肌糖原儲(chǔ)量數(shù)值，結(jié)果顯示高劑量的凍干粉組能更好的促進(jìn)肝、肌糖原的儲(chǔ)備，延緩疲勞的發(fā)生。最后對(duì)比大鼠血清中NO、MDA、SOD、GR、CAT值，結(jié)果顯示林蛙油凍干粉組能更好的清除氧化自由基，起到抗氧化抗衰老的作用。

綜上所述,不同濃度林蛙油凍干粉均具有一定抗疲勞、抗衰老作用。且高濃度優(yōu)于低濃度，本研究結(jié)果揭示了林蛙油新產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)，為林蛙油新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。