三物黃芩湯對白塞氏病小鼠炎癥因子及STAT3蛋白的影響

樸勇洙，張京，王欣波，任慧，齊堉潼，朱彬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

白塞氏病(Behcet's disease,BD)是以葡萄膜炎和結(jié)節(jié)性紅斑、生殖器潰瘍、復(fù)發(fā)性口腔潰瘍?yōu)橹饕R床特征, 并可累及胃腸道、心血管、神經(jīng)、血液等多系統(tǒng)損傷的慢性多系統(tǒng)血管炎。本病屬于免疫功能紊亂性疾病，患者往往對外界病原體的免疫反應(yīng)減弱，但是對于自身器官組織的免疫反應(yīng)卻表現(xiàn)為亢進。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)治療手段主要以服用非甾體抗炎藥、免疫制劑、糖皮質(zhì)激素, 但是因其停藥易再次發(fā)作，西醫(yī)無法徹底根除, 而中醫(yī)運用中醫(yī)藥為治療手段取得較好的臨床療效。非甾體抗炎藥作為臨床上治療白塞氏病的藥物之一, 因患者長期服用而導(dǎo)致機體對該藥耐藥性的產(chǎn)生，是治療失敗的主要原因[1]。因此, 探索白塞氏病耐藥性的分子調(diào)控機制, 尋找有效的干預(yù)靶點可為提高白塞氏病治療效果產(chǎn)生積極影響。由于長期運用三物黃芩湯治療白塞氏病患者效果顯著，為求進一步探索其作用機制，設(shè)計課題研究三物黃芩湯對白塞氏病小鼠外周血炎癥因子及相關(guān)蛋白的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取雌性清潔級4～6周齡的BALB/c小鼠，體質(zhì)量(25±2)g，在室溫(22±2)℃，相對濕度55%～60%，安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。自由攝食，給予充足清潔飲水。

1.2 藥材及制備

三物黃芩湯草藥黃芩6 g，苦參6 g，生地黃12 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供。

1.3 主要儀器

水平搖床(WD-9405B)；電泳儀(DYY-7C)；轉(zhuǎn)移槽(DYCZ-40D)；雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN)；凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B型，北京六一)。微量移液器(Proline，蘇州BIOHIT公司)；超純水系統(tǒng)(NW10LVF，香港Heal Force公司)；超速冷凍離心機(H-2050R ，長沙湖南湘儀公司)；酶標儀(ELX-800，美國BIOTEK公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特公司)；倒置相差顯微鏡(型號IX53，日本OLYMPUS公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號HF-90,中國上海力申公司)；超凈工作臺(型號SW-CJ-2FD,中國蘇州蘇凈安泰公司)。

1.4 主要試劑

全蛋白提取試劑盒(WLA019)；全蛋白提取試劑盒(WLA019)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(WLA004)；SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒(WLA013)；Western洗滌液(WLA025)；SDS - PAGE電泳液(干粉)(WLA026)；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(WLA005)；ECL發(fā)光液(WLA003)；p-STAT3(WLP2412)；STAT3(WL03207)；羊抗兔IgG-HRP(WLA023)；內(nèi)參抗體 β-actin(WL01845，中國wanleibio公司)，預(yù)染蛋白分子量標準(26616,加拿大Fermentas公司)；PVDF膜(IPVH00010,美國Millipore公司)；BSABS043(中國Biosharp公司)；脫脂奶粉(Q/NYLB 0039S,中國伊利公司)。小鼠外周淋巴細胞分離液試劑盒(產(chǎn)品編號P8620，中國索萊寶公司)；IFN-γELISA檢測試劑盒(產(chǎn)品編號SEA049Mu，中國武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)；沙利度胺(產(chǎn)品編號T126856)、ionomycin(產(chǎn)品編號I139530，中國阿拉丁公司)；PBS(產(chǎn)品編號P10033，中國雙螺旋公司)；CD4-FITC(產(chǎn)品編號11-0042-81)、IFN-γ-PE(產(chǎn)品編號12-7311-81)，(美國eBioscience公司)；PMA(產(chǎn)品編號HY-18739，美國MCE公司)；BrefeldinA(產(chǎn)品編號HY-16592，中國Aladdin公司)。

2 實驗方法

2.1 過敏原制作

取中國對蝦蝦肉，去除其頭、尾、蝦線。蝦肉被置于緩沖液A(50 mmol/L KCl、2 mmol/L NaHCO3)溶液中，充分勻漿，4 ℃離心取沉淀，重復(fù)操作4次。預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀，攪拌，將蝦肉中殘留的丙酮充分揮發(fā)。制備好的蝦肌肉丙酮粉被置于緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl、1 mol/L KCl、0.1 mmol/L DTT)中抽提過夜，4 ℃離心取上清。調(diào)節(jié)上清液的pH至4.5，并緩慢加入40%(NH4)2SO4溶液，充分攪拌，4 ℃離心取沉淀；取上清液再次加入40%(NH4)2SO4溶液，充分攪拌，4 ℃離心取沉淀。用緩沖液B分別溶解上述2次沉淀，沸水浴加熱10 min，冰上迅速冷卻，4 ℃離心，取其上清，得到提取中國對蝦原肌球蛋白液。將提取的中國對蝦原肌球蛋白液進行SDS-PAGE蛋白純度鑒定，將蛋白分裝保存用于后續(xù)實驗。

2.2 模型制作

BALB/c小鼠60只，分為空白組、模型組、沙利度胺組、三物黃芩湯各劑量組，每組10只。各組小鼠生活環(huán)境為12 h白12 h黑，溫度(22±1)℃，濕度45%～55%，自由進食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后再建立模型，除空白組外，剩余各組小鼠于第7、14、21、28天腹腔注射(0.1 mL的弗氏佐劑和0.1 mL 12 mg/mL對蝦原肌球蛋白)濃度為6 mg/mL的過敏原，建立小鼠白塞氏病模型。

2.3 實驗動物給藥

空白組小鼠給予同等體積的生理鹽水。沙利度胺組小鼠于第28天后腹腔注射75 mg/kg沙利度胺，1次/日，持續(xù)到第56天。三物黃芩湯低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組小鼠，1次/日灌胃三物黃芩湯(低劑量：1 g/kg、中劑量2 g/kg、高劑量4 g/kg)。模型組、沙利度胺組、三物黃芩湯低劑量治療組、三物黃芩湯中劑量治療組、三物黃芩湯高劑量治療組小鼠在第56天腹腔注射0.4 mL濃度為6 mg/mL的過敏原致敏激發(fā)。末次腹腔注射激發(fā)2 h后，摘眼取血一部分加肝素抗凝，一部分分離血清后儲存于-70 ℃超低溫冰箱，收集脾臟組織液氮凍存后轉(zhuǎn)入-70 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)實驗。

2.4 外周血單核細胞的分離

向管內(nèi)加入外周血，搖勻，再加入等體積室溫PBS稀釋血液。向15 mL離心管內(nèi)放入等體積淋巴細胞分離液，傾斜試管，將稀釋后的血液沿試管壁緩慢加至分層液上面。將離心管置于水平式離心機內(nèi)，18～20 ℃，2 000 rpm離心20 min。離心后，將吸管輕輕的插入灰白色層，小心的吸出PBMC。 轉(zhuǎn)入干凈離心管內(nèi)，PBS清洗細胞2次。棄上清，以后續(xù)試驗所需相應(yīng)液體質(zhì)量懸細胞。

2.5 Western印跡法檢測STAT3及P-STAT3蛋白的表達

Western blot檢測脾臟組織中STAT3及P-STAT3蛋白表達水平收集STAT3及P-STAT3，用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，用Western blot檢測STAT3及P-STAT3蛋白表達水平，取40 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉后加入一抗(β-actin antibody 1∶1 000，STAT3 1∶500，P-STAT3 1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，加HRP標記二抗(β-actin antibody 1∶5 000，STAT3 1∶5 000，P-STAT3 1∶5 000)，孵育 1h，最后利用增強化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)顯色，在暗室曝光，凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值，以觀察各組STAT3及P-STAT3蛋白表達水平。

2.6 相關(guān)炎癥因子標本采集及檢測

將IFN-γ4 000 pg/mL的標準品稀釋成1 000 pg/mL。稀釋后標準品濃度依次為：1 000 pg/mL，500 pg/mL，250 pg/mL，125 pg/mL，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL，15.6 pg/mL。洗滌，加樣酶標板加上覆膜，37 ℃溫育1 h，顯色，終止反應(yīng)，測定進行試驗，該操作嚴格按照IFN-γ試劑盒說明書進行。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血清中炎癥因子的水平

與空白組小鼠比較,模型組的炎癥因子水平明顯升高(P<0.01)，表明白塞氏病小鼠的炎癥因子水平顯著升高。給予沙利度胺、三物黃芩湯后，與模型組相比小鼠的炎癥因子水平明顯降低 (P<0.01或P<0.05)，但沙利度胺組與中藥高劑量組之間小鼠的炎癥因子水平無顯著差異(P>0.05)見表1。

表1 各組小鼠炎癥因子水平比較

3.2 各組小鼠P-STAT3蛋白含量的水平

與空白組相比，模型組小鼠的P-STAT3蛋白含量明顯升高(P<0.01)；而給予沙利度胺、三物黃芩湯后，與模型組相比小鼠的P-STAT3蛋白明顯降低(P<0.01或P<0.05)。但沙利度胺組和中藥高劑量組P-STAT3蛋白含量比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表2。

注：A：空白組;B：模型組;C：沙利度胺組;D：三物黃芩湯低劑量治療組;E：三物黃芩湯中劑量治療組;F：三物黃芩湯高劑量治療組。圖1 各組小鼠外周血P-STAT3蛋白比較

表2 各組小鼠外周血P-STAT3蛋白比較

3.3 實驗進行至第56天時測量并記錄各組小鼠體質(zhì)量

與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，沙利度胺組及三物黃芩湯高劑量組體質(zhì)量有明顯差異(P<0.01，<0.05)；三物黃芩湯中、低劑量組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠體質(zhì)量比較

4 討論

白塞氏病中醫(yī)病名稱為“狐惑病”，其中醫(yī)發(fā)病機理多與濕熱相關(guān)，查閱古籍《金匱懸解》：“狐惑者，狐疑惶惑，綿昧不明，狀如傷寒。……此蓋濕氣遏郁，精神昏憒之病也。濕邪淫泆，上下熏蒸，浸漬糜爛，肌肉剝蝕。”三物黃芩湯具有清熱涼血滋陰, 解毒燥濕堅陰之效，黃芩、生地黃、苦參均為味苦、性寒之品，黃芩、苦參能夠清熱燥濕除脾胃之濕熱之邪，生地黃滋陰清熱使熱祛而不傷陰津，三物黃芩湯首見于《金匱要略·婦人產(chǎn)后病脈證并治第十二》曰:“婦人在草蓐……頭痛者, 與小柴胡湯, 頭不痛但煩者, 此湯主之。”方中黃芩中黃芩苷 (baicalin) 分子式為C21H18O11，是從傳統(tǒng)中藥黃芩中提取的一種經(jīng)過尿嘧啶核甙二磷酸鹽葡萄糖醛酸化的黃酮類葡萄糖醛酸苷， 是黃芩的主要有效成分之一[2]。黃芩苷能夠抑制白介素1β細胞因子，并且抑制炎癥相關(guān)蛋白酶的轉(zhuǎn)錄水平從而緩解炎癥反應(yīng)，延長細胞生命力[3]。氧化苦參堿是苦參中的主要起效成分，可以雙向調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖，又能夠抑制TNF-α、IL-6和IL-8等炎癥因子凸顯其抗炎免疫的作用[ 4]。方中生地黃為君藥, 行涼血通利、滋陰益腎的功效, 通過藥理研究發(fā)現(xiàn)功效似糖皮質(zhì)激素免疫抑制作用[5]。綜上所述三物黃芩湯中的三味中藥均有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用，同時在臨床治療白塞氏病患者療效顯著為本研究奠定了研究基礎(chǔ)。

白塞病是一種多系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，具有復(fù)雜的遺傳背景，導(dǎo)致先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的促炎性激活[6-7]。CD4+和CD8+T細胞都產(chǎn)生Th1型促炎細胞因子白細胞介素2、白細胞介素12和干擾素(IFN-γ)在BD的外周血(PB)和炎癥組織中增加[8-9]。Th17細胞是一個相對較新的輔助性T細胞亞群，主要產(chǎn)生白細胞介素-17A、白細胞介素-17F、白細胞介素-22和腫瘤壞死因子(腫瘤壞死因子-α)[10]。最近的數(shù)據(jù)也暗示白細胞介素-17和Th17型應(yīng)答在BD中參與發(fā)病機理[11-12]。活躍BD的特點是白細胞介素-6、白細胞介素-17、白細胞介素-23和活化的Th17細胞血清水平高[13-15]。STAT3在Th17分化和白介素-17產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[16]。STAT3激活的特征在于STAT3磷酸化，此前的研究表明活躍性白塞氏病患者表現(xiàn)出STAT3磷酸化水平升高[17-18]。JAK/STAT信號通路對于先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活至關(guān)重要。干擾素γ受體、白細胞介素2R和白細胞介素6R通過JAK1信號，與JAK2或JAK3配對，而白細胞介素12和白細胞介素23通過JAK2/Tyk2途徑激活[19]。STAT3對調(diào)節(jié)Th17的平衡至關(guān)重要以及促進CD4+T細胞增殖。STAT3結(jié)合多個基因，尤其是白介素-6，參與Th17細胞的分化、激活、增殖和存活，調(diào)節(jié)表達和表觀遺傳修飾。STAT3在IFN-γ信號通路中也有重要作用，其高度參與大多數(shù)自身免疫過程。因此，STAT3在炎癥和體內(nèi)平衡中協(xié)調(diào)了T細胞功能的多個關(guān)鍵方面[20]。有研究已經(jīng)證明JAK1/STAT3信號通路在BD中被激活，可能通過升高血清和組織中Th1/Th17型細胞因子的表達[21]。所以抑制STAT的磷酸化在治療白塞病至關(guān)重要，實驗研究通過觀察炎癥因子IFN-γ干擾素、白介素17A的含量及P-STAT3蛋白表達水平來討論三物黃芩湯在白塞氏病中的作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)運用中藥高劑量組和西藥沙利度胺組治療一個月后與模型組相比小鼠的炎癥因子水平和P-STAT3蛋白明顯降低，說明三物黃芩湯和沙利度胺均可降低白塞氏病小鼠的炎癥因子和P-STAT3蛋白含量，實驗證明了三物黃芩湯可以降低炎癥因子水平、抑制STAT3的磷酸化，其抑制STAT3的磷酸化可能與JAK1/STAT3信號通路有關(guān)，本文為中藥治療白塞氏病提供新思路。