基于網(wǎng)絡藥理學探討丹參-葛根藥對治療糖尿病心肌損傷的分子機制

劉思瑩，凌爽，李雪瑩，劉欣欣，肖洪彬*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病心肌損傷是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥，是機體在糖脂代謝紊亂的基礎上長期發(fā)展而誘發(fā)的心肌結構和功能的損傷而引發(fā)的微血管病變，也是糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率的重要原因。

丹參-葛根藥對是《施今墨對藥》中益胃止渴健脾降糖中的一對，葛根甘平，輕揚升發(fā)，能解肌退熱，生津止渴，滋潤筋脈，擴張心腦血管，改善血液循環(huán)，降低血糖；丹參色赤入血，活血化瘀，行血止痛，祛瘀生新，涼血消癰，鎮(zhèn)靜安神，降低血糖。二藥參合，相互促進，活血化瘀，祛瘀生新，降低血糖力量增強[1]。研究發(fā)現(xiàn)，丹參、葛根都具有調節(jié)心血管的功能，在改善糖尿病微血管病變[2]、心肌缺血[3]、心肌損傷[4]方面都具有顯著效果，但對于二藥在糖尿病血管病和心肌損傷保護作用的藥效學和作用機制研究相對較少。

中藥網(wǎng)絡藥理學是在生物信息學的基礎上，整合多個中藥數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)分析軟件對中藥化學成分、作用靶點以及疾病的等信息進行分析，并構建“成分-靶點-基因-疾病”的分子網(wǎng)絡，闡述其生物學功能和作用機制，其研究方法與中藥及中藥復方的多組分、多靶點、多通路等特點相吻合，也正符合中醫(yī)辨證論治、整體觀、系統(tǒng)觀的醫(yī)療理念相符[5-6]。本文采用網(wǎng)絡藥理學研究方法利用“成分-靶點-疾病”的思路對“丹參-葛根”藥對治療糖尿病心肌損傷構建網(wǎng)絡拓撲模型，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析對“丹參-葛根”藥對的生物學功能和作用機制提供更準確的信息，希望對今后的科學研究和臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 丹參-葛根化學成分和靶點篩選

利用TCMSP (中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，收集丹參、葛根主要化學成分及其對應的靶點。采用網(wǎng)絡藥理學常用的化學成分篩選方法，以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為 ADME篩選條件[7]。

1.2 疾病靶點的篩選

通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫 (http://www.genecards.org) 和OMIM 數(shù) 據(jù) 庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim) 進行檢索，輸入關鍵詞diabetic heart injury，DMI和diabetes cardiomyopathy，DCM獲得糖尿病心肌損傷相關的疾病靶點。

1.3 藥對和疾病交集靶點的網(wǎng)絡構建

將疾病靶點與藥物成分靶點輸入在線Venny 2.1軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖，獲得藥對與疾病的交集靶點。將篩選得到的交集靶標蛋白輸入STRING 10.5平臺(https://string-db.org/)構建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，隱藏網(wǎng)絡中孤立的蛋白，其他參數(shù)保持默認設置，導出網(wǎng)絡互作圖，分析統(tǒng)計靶標蛋白關聯(lián)頻次。

1.4 藥對-疾病-靶點的網(wǎng)絡構建

利用Cytoscape 3.7.2(http:/ /www.cytoscape.org/)[8]軟件。將“丹參-葛根”藥對化合物和疾病交集靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建藥對-靶點-疾病網(wǎng)絡，使藥物分子與交集靶點關系達到可視化，進行網(wǎng)絡拓撲學分析，以靶點度值(Degree)和中心度(betweenness centrality)作為拓撲結構分析的重要參數(shù)，預測藥對中有效成分和靶標蛋白在網(wǎng)絡中的重要程度。

1.5 丹參-葛根藥對治療糖尿病心肌損傷預測靶標富集分析

利用DAVID(https:/ /david.ncifcrf.gov)在線分析工具將靶點基因symbol轉化為基因ID，并進行基因本體(GO)富集分析，再利用Kabas3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)在線軟件進行生物通路KEGG富集分析，并使用R語言cluster Profiler工具包對富集分析結果進行可視化操作，選擇P<0.01顯示結果。

2 結果

2.1 丹參-葛根藥對有效成分和靶點的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以OB≥30%和DL≥0.18為參數(shù)共收集到了69個滿足條件的化合物，剔除預測不到靶點的化合物共得到41個有效成分，其中丹參38個，葛根3個，見表1。同時得到的有效靶點共434個，剔除重復靶點共得到65個有效作用靶點，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：丹參中化合物紫丹參萜醚B(przewalskin b)，分子編號MOL007064，在41個化合物中具有較高的OB值(110.32%)。

2.2 與糖尿病心肌損傷相關疾病靶點篩選

通過 Genecard、OMIM數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得糖尿病心肌損傷相關的疾病靶點580個。將580個疾病靶點與65個藥對成分靶點通過Venny 2.1軟件取交集后得到疾病-藥物成分共同靶點29個，見圖1。

圖1 疾病-藥對交集靶點關系圖

2.3 藥對-疾病交集靶點PPI網(wǎng)絡構建

將交集靶標蛋白在STRING 10.5平臺(https://string-db.org/)構建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡，設置置信度大于0.4，隱藏孤立蛋白后，共得到28個節(jié)點，107條線，平均節(jié)點度值(degree)為7.38，見圖2。節(jié)點表示靶標蛋白，每條邊表示靶標蛋白之間的作用關系。從作用關系圖可看出有13個靶點大于平均度值，成為連結網(wǎng)絡其他節(jié)點的樞紐，主要有IL-6、VEGFA、CASP3、FOS、CASP8、CASP9、ESR1、MCL1、NFKBIA、PPARG、GSK3B、ICAM1、PRKCA，說明這些蛋白質在PPI中發(fā)揮著關鍵的作用。

圖2 丹參-葛根治療糖尿病心肌損傷的靶點蛋白質交互作用圖

2.4 藥對化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡構建

應用cytoscape3.7.2軟件構建“丹參-葛根”藥對-疾病-核心靶點之間的關系網(wǎng)絡，見圖3，共包括70個節(jié)點，包括41個化合物節(jié)點和29個核心靶點節(jié)點，組成454條靶點聯(lián)系；其中，藍色橢圓表示化合物，紅色橢圓表示“藥對-疾病”作用靶點，節(jié)點連線與度值成正比例關系。度中心性(degree centrality，DC)參數(shù)是評價網(wǎng)絡節(jié)點重要核心指標，其數(shù)值越大，說明節(jié)點越接近網(wǎng)絡的中心[9]。核心靶點中度值較高的有 PTGS1(28)、CHRM3(25)、CHRM2(20)等，表明丹參-葛根藥對化合物可能通過高度值的靶點起到發(fā)揮治療糖尿病心肌損傷的作用。

圖3 丹參-葛根活性成分-DMI交集靶點網(wǎng)絡圖

2.5 預測靶標的GO和KEGG富集分析

應用DAVID在線軟件對丹參-葛根藥對治療DMI的交集靶點基因進行GO功能富集分析，得到前20條目富集結果，見圖4。靶點關聯(lián)的分子功能主要有蛋白質異二聚活性、類固醇激素受體活性、內肽酶活性、半胱氨酸型內肽酶活性、類固醇結合、配體調節(jié)序列特異性DNA結合-轉錄因子活性、半胱氨酸型肽酶活性、RNA聚合酶II轉錄因子結合、神經(jīng)遞質受體活性、核受體活性、細胞因子受體結合等。

圖4 丹參-葛根治療 DMI作用靶點Go富集分析結果

利用Kabas3.0將交集靶點做富集通路分析，取前20條主要通路及富集的基因，將得到的通路富集分析結果使用R語言clusterProfiler工具包繪制氣泡圖，選擇P<0.01顯示結果，見圖5。在顯示的生物通路中主要涉及凋亡信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、內分泌IL-17信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、催乳素信號通路、p53信號通路、內分泌抵抗、Toll樣受體信號通路、胰島素抵抗、HIF-1信號通路、甲狀腺激素信號通路等。

圖5 丹參-葛根治療DMI作用靶點KEGG富集氣泡圖

3 討論

丹參、葛根在糖尿病及其并發(fā)癥的治療中均屬高頻使用單味藥。相關研究表明，治療糖尿病心血管并發(fā)癥最常用的中藥中，丹參、葛根排在了前10位[10]。而該藥對的組合應用在現(xiàn)代藥理學實驗證實，二者具有降低血糖、調節(jié)糖代謝的作用[11-12]。

本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，探討和分析了丹參-葛根藥對治療糖尿病心肌損傷的分子機制。篩選了丹參-葛根藥對共41個特征化學成分，主要作用65個靶點，其中29個靶點為藥對與疾病交集靶點。PPI網(wǎng)絡圖顯示了核心靶點的相互作用關系，網(wǎng)絡中靶點連接度越大，表明該藥對通過該靶點治療DMI的可能性越大。其中IL-6(度值19)、VGEFA(度值18)、Caspase3(度值17)、FOS(度值14)、ESR1(度值12)、Caspase8(度值12)、Caspase9(度值12)等靶蛋白在網(wǎng)絡中連接基因數(shù)遠高于其他，說明這些關鍵靶點又是相互作用協(xié)同起到治療糖尿病心肌損傷的作用。 Caspase3、Caspase7、Caspase8、Caspase9屬于Caspases家族成員中促凋亡因子，是一組具有相似氨基酸序列、空間結構和酶特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡信號的刺激下caspase參與了糖尿病胰島β細胞的凋亡[13]。IL-6參與炎癥反應，降低IL-6的水平可以減輕糖尿病患者血管病變，其機制可能與抑制炎癥反應有關[14]。王明樂等[15]采用丹參注射液對2型糖尿病下肢血管病變患者進行干預，血清炎癥因子IL-6、C反應蛋白(CRP)的炎癥指標明顯降低,表明丹參注射液對炎癥因子的干預效果顯著。靶點基因通路富集分析主要集中在凋亡信號通路(9個靶點參與)、PI3K-Akt信號通路(8個靶點參與)、TNF信號通路(7個靶點參與)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(6個靶點參與)、IL-17信號通路(6個靶點參與)等信號通路。BULANI等[16]研究表明，糖尿病心肌病與心肌細胞凋亡有密切相關，高糖環(huán)境會增加心肌細胞的凋亡。張玲等[17]研究葛根素能夠改善DM模型大鼠的血糖并調控Bcl-2表達，下調Caspase3、Cyt-C蛋白表達，從而使心肌細胞凋亡率下降。孫曉慧等人[18]研究表明Sirt1 通過負調控 PI3K/Akt/mTOR信號通路參與糖尿病心肌損傷，參與早期糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。袁媛等[19]證實了葛根素對體內外AGEs的形成具有明顯的抑制作用。白介素17(IL-17)在心臟間質纖維化的發(fā)病機理中起著重要作用。Zhang Y等[20]通過敲除IL-17消除了高糖誘導的AK081284的上調，從而抑制了心臟成纖維細胞(CFs)中膠原和TGFβ1的產生。證明了 IL-17 / AK081284 /TGFβ1信號通路介導高葡萄糖誘導的膠原蛋白產生。IL-17的缺失能夠減輕心肌纖維化并改善糖尿病小鼠的心臟功能。該研究表明IL-17抑制對與纖維化有關的糖尿病性心肌病的治療潛力。

綜上所述，網(wǎng)絡藥理學的平臺分析和預測結果和已有實驗驗證結果基本一致，說明通過網(wǎng)絡藥理學的方法能夠在分子層面為藥物對疾病的作用機制提供一些潛在依據(jù)和線索，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法揭示了丹參-葛根藥對治療DMI 的多成分、多靶點和多通路的協(xié)同作用的特點，為進一步深入研究該藥對組合配伍或藥物單體化合物特有的藥理作用以及治療糖尿病心肌損傷的作用機制提供了重要的理論依據(jù)。