尖葉假龍膽對酒精性肝損傷模型大鼠脂代謝及氧化-抗氧化系統的影響

孫爽 ，樸圣愛 ，張雙良，李響，趙啟騰，郭鐘秀，胡曉陽,4*

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.河北省滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000; 4.雞西市人民醫院醫療集團，黑龍江 雞西 158100)

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)是指長期過量飲用含有乙醇成分的酒水所造成的肝臟代謝紊亂。酒精對肝臟的損害是逐步積累的，進入體內的酒精，只有少部分可以通過肺臟呼吸作用和腎臟尿液排出體外，但是體內剩余的乙醇會在肝臟中進行代謝，并主要經乙醇脫氫酶(ADH)與微粒體乙醇氧化酶體系(MEOS)進行代謝。酒精經ADH和MEOS等代謝過程中發生的氧化應激反應是ALD的一個重要原因[1]。現代人由于超量飲酒引發的ALD人群逐年上升，因此關于防治ALD的中醫藥研究意義重大。

尖葉假龍膽(Gentianellaacuta)屬于龍膽科假龍膽屬，也稱苦龍膽。大部分產于大興安嶺、蒙古高原等地，作為地方藥以全草入藥，具有護肝的作用[2-3]。尖葉假龍膽可用于解酒，同時還會減輕宿醉導致的惡心欲嘔、乏力等癥狀。前期研究表明[4]，尖葉假龍膽具有明顯的抗氧化活性以及調節體內天冬氨酸轉移酶和超氧化物歧化酶等水平，而在長期飲用酒精類飲品后的ALD患者，使體內乙醇代謝過程增強，加重肝臟內的氧化應激反應、并通過某些酶激活相關基因的表達而產生，因此推測尖葉假龍膽可能具有防治ALD的功能。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗動物由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供，60只雄性Wistar大鼠平均體質量為(200±20)g，許可證編號:SCXK(黑)2018-001，符合藥理學實驗相關要求。將大鼠在可控溫度的實驗室條件下飼養，給予標準食物與水。本實驗按照國家實驗動物保護和使用指南，并經本單位實驗動物倫理委員會批準后進行。

1.2 藥物

陽性對照藥物采用吉林通化東寶藥業股份有限公司生產的東寶甘泰片。尖葉假龍膽樣品經王振月教授鑒定為Gentianellaacuta的全草。樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.3 試劑與儀器

ADPN、TNF-α、NEFA、MDA、ALDH、ADH測定試劑盒：上海聯碩生物科技有限；MIKRO22/22R臺式(常溫/冷凍)離心機：德國Hettich公司；Infinite M200 pro多功能酶標儀：瑞士Tecan公司；SZ-96自動純水蒸餾器、恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；紫外分光光度計：日本島津制作所；DH4000AB型電熱恒溫培養箱:天津市泰斯特儀器有限公司；CS213電熱烤箱：重慶儀器設備廠；LEICA-RM2135組織切片機：德國萊卡公司；Nikon 50i型正置顯微鏡：日本尼康公司。

2 方法

2.1 藥物制備

取東寶甘泰片粉碎后置于量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋成0.04 g/mL的溶液，陽性藥組大鼠給藥量為10 mL/(kg·d)，即給藥量為0.4 g/d，相當于臨床成人常用量的6.25倍。

稱取1 kg尖葉假龍膽全草，粉碎后，置圓底燒瓶中，加入20 L 75%乙醇浸泡2 h，加熱回流提取過濾，重復2次，合并濾液。將所得濾液分多次置旋轉蒸發器中進行減壓濃縮，從而得到尖葉假龍膽浸膏。取出尖葉假龍膽浸膏(按原生藥材1 kg計)，置2 000 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至2 L，即為高劑量組服用劑量，相當于含生藥材濃度為0.50 g/mL；取出1 L高劑量組服用溶液1 L，置2 L量瓶中，加蒸餾水至2 L，即為中劑量組服用劑量，相當于含生藥材濃度為0.25 g/mL；按照相同方法，取中濃度1 L，加蒸餾水1 L，即為低劑量組，相當于含生藥材濃度為0.13 g/mL。

2.2 分組、造模及給藥

將60只Wistar大鼠隨機分為6組，空白組、模型組、陽性藥組各10只，尖葉假龍膽劑量組分為高中低3個劑量組，每組10只。60只大鼠在適應性飼養1周后，除空白組給予生理鹽水外，其他各組均使用梯度50%酒精灌胃方法進行造模[4](梯度酒精灌胃造模方法為第1周2 mL/kg，第2周4 mL/kg，第3周6 mL/kg，從第4周開始到第8周結束7 mL/kg)，均在上午進行。于第7、8周每日下午分別給予高、中、低劑量組大鼠相應濃度的尖葉假龍膽稀釋液10 mL/kg，陽性藥組給予東寶肝泰稀釋液10 mL/kg，空白組、模型組給予生理鹽水10 mL/kg。造模后，各組大鼠均有死亡,至第8周,空白組、陽性藥組、高劑量組、低劑量組大鼠各死亡1只、模型組、中劑量組大鼠各死亡2只。

2.3 取材及檢測

第8周末最后一次給藥后，22:00時開始禁食水，12 h后，用20%烏拉坦溶液5 mL/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱凍存，測試前先于恒溫水浴鍋中37 ℃復溫，應用多功能酶標儀和紫外分光光度計檢測樣本ADPN、TNF-α、NEFA濃度，得出數據并做記錄。同時在腹主動脈取血后，迅速取出肝臟，剪取1 g肝組織，加9 g生理鹽水于手動勻漿器中，置于冰水混合物中充分研磨，得10%組織勻漿，倒入離心管中于低溫冷凍離心機中4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，移至編號的EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存備用，測試前先于恒溫水浴鍋中復溫，然后采用多功能酶標儀和紫外分光光度計檢測ALDH、ADH、MDA水平，得出數據并記錄。并于肝右葉相同部位取材,及時將其放入各組多聚甲醛溶液中浸泡1周，后乙醇溶液脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片(片厚5 μm)，采用HE染色，具體方法：石蠟切片脫蠟至水, 蘇木素染液染色10 min，充分水洗，1%鹽酸乙醇分色1 s，充分水洗，自來水返藍10 min，伊紅染液染色30 s，充分水洗，中性樹脂封片，光鏡下觀察肝組織病理形態學變化。

2.4 統計學處理

采用SPSS22.0統計軟件對數據進行處理，每組數值以均值±標準差表示，各組之間的比較使用單因素方差分析以及Dunnett＇s檢驗，本實驗中，檢驗水準定為α=0.05，以P≤0.05作為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 尖葉假龍膽對ALD大鼠血清中ADPN、TNF-α、NEFA水平的影響

與空白組相比，模型組大鼠血清ADPN水平明顯降低(P<0.01)，差異極顯著；與模型組相比，陽性藥組、尖葉假龍膽高劑量組大鼠血清ADPN水平明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與陽性藥組相比，尖葉假龍膽高劑量組血清ADPN水平明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與尖葉假龍膽高劑量組相比，中、低劑量組血清ADPN水平明顯偏低(P<0.05)，差異顯著；與尖葉假龍膽中低劑量組相比，血清ADPN水平無明顯差異(P>0.05)。結果見表2。

與空白組相比，模型組大鼠血清TNF-α含量明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與模型組相比，陽性藥組、尖葉假龍膽高、中、低劑量組TNF-α含量明顯降低(P<0.05)，差異顯著；與尖葉假龍膽高劑量組相比，尖葉假龍膽中、低劑量組TNF-α含量明顯偏高(P<0.05)，差異顯著；與尖葉假龍膽中劑量組相比，尖葉假龍膽低劑量組TNF-α含量明顯偏高(P<0.05)，差異顯著。結果見表2。

與空白組相比，模型組大鼠血清NEFA濃度明顯升高(P<0.05),差異顯著；與模型組相比，陽性藥組大鼠血清NEFA濃度升高，尖葉假龍膽高、中、低劑量組濃度明顯降低，尖葉假龍膽高劑量組NEFA濃度降低幅度最大(P<0.05)，差異顯著；尖葉假龍膽高、中、低三劑量組NEFA濃度逐漸升高，高劑量組濃度最低(P<0.05)，差異顯著。結果見表2。

3.2 尖葉假龍膽對ALD大鼠肝組織中ALDH、ADH、MDA含量的影響

與空白組相比，模型組大鼠肝組織中ALDH濃度降低(P<0.05)，差異顯著；與模型組相比，陽性藥組、尖葉假龍膽低劑量組ALDH含量變化不明顯(P>0.05)；尖葉假龍膽高、中劑量組ALDH含量明顯升高(P<0.05)，差異顯著；尖葉假龍膽高、中、低劑量組之間相比，ALDH含量逐漸降低(P<0.05)，差異顯著。結果見表3。

與空白組相比，模型組大鼠肝組織中ADH活力明顯降低(P<0.05)，差異顯著；與模型組相比，陽性藥組、尖葉假龍膽高、中、低劑量組ADH活力明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與陽性藥組相比，尖葉假龍膽高、中劑量組ADH活力明顯升高(P<0.05)，差異顯著；尖葉假龍膽低劑量組ADH活力變化不明顯(P>0.05)。結果見表3。

與空白組相比，模型組大鼠肝組織MDA含量明顯升高(P<0.05)，差異顯著；與模型組相比，陽性藥組、尖葉假龍膽低劑量組MDA含量變化不明顯(P>0.05)，尖葉假龍膽高、中劑量組MDA含量明顯降低(P<0.01)，差異極顯著；高、中劑量組MDA含量變化不明顯(P>0.05)；與高、中劑量組相比，低劑量組MDA含量明顯升高(P<0.05)，差異顯著。結果見表3。

3.3 尖葉假龍膽對ALD大鼠肝組織病理學的影響

空白組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列成索，圍繞中央靜脈以輻射狀排列，細胞大小基本一致，呈多邊形，可見雙核，細胞內未發現明顯腔泡，肝小葉內和肝小葉間未發現明顯纖維組織增生，見圖1a。模型組大鼠可見多個區域肝小葉結構破壞，肝索排列雜亂，肝竇間隙增大，中央靜脈周圍的肝細胞腫大明顯，胞質淺染，并有水樣、氣球樣變性，可見大量炎性細胞浸潤，距離中央靜脈較遠的肝細胞內出現大小不等的空泡，可見有明顯脂肪變性，見圖1b。陽性藥組大鼠紊亂排列的肝小葉數量較模型組少，中央靜脈周圍的肝細胞胞質染色比模型組深，水樣變性也較輕，遠離中央靜脈的肝細胞內空泡較小，而且數量較模型組少，見圖1c。尖葉假龍膽各劑量組肝臟組織結構紊亂的肝小葉數量較模型組少，炎癥反應輕，炎性細胞浸潤程度輕微。其中高劑量組更接近空白組，雖有少量脂肪沉積，但無纖維組織增生。見圖1d、1e、1f。

圖1 尖葉假龍膽對ALD大鼠肝組織病理學的影響(HE 200×)

4 討論

ADPN是一種內源性生物活性多肽或蛋白質，由脂肪細胞分泌，對機體具有廣泛的保護作用[5]，Bertolani C等人研究表明[6]，肝臟病變時出現ADPN的水平失調，會導致一系列肝臟問題。研究表明[7]ALD的發生與血清ADPN水平下降、肝臟細胞ADPN受體表達下降、肝細胞內ADPN傳導通路受損有關，ADPN通過調節信號傳導，能夠對ALD提供保護作用。有關實驗研究發現[8-9]通過某些飲食或藥物誘導的ADPN表達可以阻止或延緩ALD的進展。雖然ADPN發揮保護ALD的分子作用機制尚未明確，但有一點可以被證明，ADPN是通過調節一個復雜的信號網絡系統從而發揮保護作用，最終使得肝臟脂質累積的下降[6]。TNF-α是由激活后的單核-巨噬細胞產生的一種單核細胞因子[10]，是肝細胞損傷發生過程中的主要參與因子之一。相關研究表明TNF-α介導了內毒素對肝損傷的作用，同時在乙醇、四氯化碳等化學物質引起的肝臟損傷過程中起到了重要的促炎介質作用[11]。可能機制有如下幾點：介導脂類介質產生，誘導氧自由基產生，誘導一氧化氮的產生，活化中性粒細胞，誘導肝細胞凋亡[12]。總之，TNF-α引起的肝損傷是一個復雜的過程，TNF-α不但能直接損傷肝細胞，而且可以通過誘導產生炎癥介質、激活中性粒細胞等途徑產生間接毒性作用。ADPN可以抑制TNF-α的產生，同時減少TNF-α的釋放，雙管齊下，減輕ALD的病理反應。NEFA通過內源性和外源性兩種途徑來促進肝臟細胞的破壞凋亡，并促進促炎因子的合成，從而導致肝細胞炎性損傷[13]。尖葉假龍膽通過降低血清中NEFA的濃度來減輕炎性損傷，從而減輕ALD的病理反應。

已有研究證實[14]，ADH和ALDH在肝臟分解代謝外來酒精過程中發揮了重要作用。首先乙醇會在ADH的作用下代謝為乙醛，然后乙醛會在線粒體ALDH作用下代謝為乙酸，最終乙酸通過三羧酸循環代謝成為終產物二氧化碳和水[15]。尖葉假龍膽通過升高肝組織中ALDH、ADH濃度來促進乙醇的代謝，從而對ALD產生保護作用。MDA是一種具有細胞毒性的過氧化產物,通過檢測肝組織中MDA水平變化可以反映肝細胞膜脂質氧化應激程度[16]，說明尖葉假龍膽可以抑制體內的脂質過氧化作用，從而保護肝臟。

上述實驗表明，尖葉假龍膽對ALD具有保護作用，其機制可能是尖葉假龍膽可以促進ADPN的生成，增加脂質代謝，促進ALDH、ADH的分泌，加快肝臟分解代謝外來酒精，降低TNF-α、NEFA、MDA水平，減少酒精對肝臟造成的氧化損傷。