氨基酸增值尿素對水稻苗期生長及根際微生物菌群的影響

程 林，章力干，張國漪，齊永波，郜紅建，疏 晴，張富源，朱 榮，蔣 東

（安徽農業大學資源與環境學院/農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室，安徽合肥 230036）

水稻根系是吸收水分和養分的器官，根系形態及其發育狀況與地上部器官建成和產量密切關聯[1–2]。水稻根系的生長與形態構成受諸多因素的影響，其中稻田水分管理和氮素養分形態特征對水稻根系生長、養分吸收和產量形成影響巨大[3]。根土界面是微生物和水稻根系發育異常活躍的區域，不同水、氮管理必然先通過影響水稻根際土壤生態系統的功能，進而影響地上部分的生長發育[4]。根際作為植物—土壤—微生物相互作用的微區域，既是養分和水分從土壤進入作物系統參與物質循環的重要門戶，又是土壤微生物非?；钴S的場所，也是養分生物有效性研究關注的焦點[5]。不同水分條件、不同氮肥運籌和不同氮肥種類對土壤微生物的種類和豐度產生明顯影響，而且不同微生物對水分和氮肥響應程度不同[6–7]，有研究表明土壤微生物多樣性與作物生產力具有一定的相關性[8]。不同水分管理體現在水稻生產實際中即是旱作和水作，因此，研究不同稻作模式下的氮素養分管理對水稻根系生長和根際微生物菌群響應機制具有重要的理論價值和實際意義。

氨基酸作為一種生物刺激素能促進作物根系生長，提高體內相關酶基因表達，增加相關酶的活性，提升作物對逆境的適應性[9–10]。以氨基酸為增效劑生產的氨基酸多元微肥、水溶肥和復合肥有廣泛的應用，其中水稻上已取得了顯著效果[11–12]。在生產實踐中，有關氨基酸增效劑與不同養分復配創制水溶肥、葉面肥、多元微肥和增效復合肥等已有了長足的發展。據報道，氨基酸增效劑與礦質養分復配施用，能夠促進作物對肥料中養分的吸收利用、提高產量、改善品質、減少養分損失，降低化肥施用的環境風險[13–14]。利用氨基酸增效劑與氮肥復配創制的新型氨基酸增值肥料也有相關報道[15–16]，但有關氨基酸增值尿素在不同稻作模式下對水稻根系生長、水稻根際養分調控以及根際土壤微生物群落的影響鮮見報道。本研究擬從氨基酸增值尿素在水稻中的應用入手，模擬當前水稻水作和旱作模式，系統研究氨基酸增值尿素對不同稻作方式下的水稻根系生長和根際效應，以期為不同稻作模式的水稻早期生長、水氮調控、根際環境優化以及氨基酸增值尿素的合理施用提供依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻品種為‘兩優華6’(Oryza sativaL.)。供試土壤采自安徽農業大學合肥農業園，土壤類型為下蜀系母質發育的水稻土，土壤基本理化性質為：有機質10.24 g/kg、全氮0.78 g/kg、堿解氮42.4 mg/kg、有效磷 9.35 mg/kg、速效鉀 138.62 mg/kg、pH 6.57。供試氨基酸液體增效劑由中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所提供，氨基酸總量為20%，主要成分為谷氨酸、賴氨酸、纈氨酸和丙氨酸。本試驗用氨基酸增值尿素產品是在130℃下熔融普通尿素，將氨基酸增效劑液體緩緩加入，最終形成含5%氨基酸的增值尿素。尿素為市售品牌產品(N含量46%)，磷、鉀肥為市售品牌磷酸二氫鉀和氯化鉀。

1.2 試驗設計

水稻盆栽試驗于2018年6—7月在安徽農業大學試驗場進行。試驗設6個處理：旱作不施尿素(GCK)、旱作施普通尿素 (GU)、旱作施氨基酸增值尿素 (GAU)、水作不施尿素 (SCK)、水作施普通尿素 (SU) 和水作施氨基酸增值尿素 (SAU)。

試驗盆缽裝土5 kg，施肥量折算為N、P2O5和K2O量分別為300、150和100 mg/kg，所有處理磷鉀肥等量施入。每盆移栽水稻幼苗5穴，每穴2株。培養期間，旱作處理保持土壤含水量為田間持水量的70%～80%，生長期間采用重量法控制土壤水分，水作淹水深度為1 cm。每個處理5次重復，隨機排列。水稻幼苗培養30天后收獲，采集水稻根際土壤樣品[17]，一部分立即裝入塑封袋密封，于-80℃低溫冰箱保存，用于土壤微生物分析，另一部分用于土壤理化性狀分析；采集根際土壤后的稻株用高壓水槍沖洗泥土，再用蒸餾水淋洗2次，用吸水紙吸干稻株上水分，分離地上與地下部分測定相關生物學性狀，地下根系進一步用于根系形態分析。

1.3 測定方法

土壤有機碳采用重鉻酸鉀氧化法，全氮采用凱氏定氮法，硝態氮采用酚二磺酸比色法，銨態氮采用KCl浸提—靛酚藍比色法[18]測定。根系形態分析采用掃描儀 (Epson perfection V700 photo，Japan) 數字化掃描，然后用根系形態分析專用軟件 (WinRHIZO_ProV2007d，Regent Instrument Inc. Canada) 分析總根長、總根表面積、總根體積、平均根系直徑、根尖數、分支數、交叉數等根系形態參數，根系形態參數為3次重復的平均值。土壤細菌數量采用稀釋平板計數法測定，氨化細菌、硝化細菌數量采用培養顯色法[19]測定。

土壤微生物總DNA采用DNA提取試劑盒進行精提，將提取純化后的DNA作為PCR模板，用具有特征性引物 338F (5′–ACTCCTACGGGAGGCAGCA–3′) 和 806R (5′–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3')擴增細菌16S rRNA V3+V4區，在每個樣品的上游引物5′端添加Barcode序列區分樣品。每個樣品重復3次，將相同樣品的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收產物。進而構建文庫，將構建好的文庫經過Qubit定量檢測，合格后使用Illumina MiSeq高通量測序平臺進行雙末端測序。測序服務委托北京百邁客生物科技公司完成。

1.4 數據分析

數據采用 Excel 2017整理后，運用 SPSS 22進行方差分析和相關性分析，用Origin 8.0軟件繪圖；通過高通量測序進行系統發育樹和相關指數冗余分析；使用Canoco 5軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 氨基酸增值尿素對水稻生長的影響

如表1所示，兩種稻作方式下，氮肥施用均明顯促進了水稻的生長，與不施氮肥處理比較，水稻株高、地上部鮮重和根系鮮重顯著增加。不同的氮肥種類對水稻生長的促進作用表現不一，與普通尿素處理相比，氨基酸增值尿素處理對旱作和水作條件下水稻株高、地上部鮮重均無顯著影響，而對地下根系生物量的影響達顯著水平。旱作和水作模式下，氨基酸增值尿素處理較普通尿素處理水稻根系鮮重分別增加9.65%和7.56%，表現出明顯的促根生長效應。本試驗條件下，不同稻作方式對水稻生長和地上生物量未見顯著影響。

表1 氨基酸增值尿素對水稻苗期生物學性狀的影響Table 1 Effects of amino acid value-added urea on biological characters of rice seedling

2.2 氨基酸增值尿素對水稻根系形態特征的影響

由表2可知，不同氮肥種類和稻作方式對水稻根系形態均產生了顯著影響。與普通尿素比較，兩種稻作模式下，氨基酸增值尿素均顯著增加了水稻的根長、根直徑、根表面積、根體積、根尖數和根投影面積。旱作模式下，GAU較GU處理的水稻根長、根直徑、根表面積和根尖數分別提高45.06%、25.93%、6.17%、和90.52%；水作模式下，SAU較SU處理的水稻根長、根直徑、根表面積和根尖數分別提高13.89%、13.54%、9.51%和89.05%。從不同稻作模式的影響看，旱作模式的根長、根直徑、根表面積和根尖數均明顯低于水作模式。普通尿素的GU處理較SU處理的根長、根直徑、根表面積和根尖數分別降低了26.20%、15.63%、2.52%和13.95%；氨基酸增值尿素的GAU處理較SAU 處理的根長、根直徑、根表面積和根尖數分別降低了6.00%、6.42%、5.49%和13.28%。從降低幅度看，氨基酸增值尿素施用較普通尿素明顯緩解了水稻旱作模式下水分脅迫對根系形態建成的抑制效應。

表2 氨基酸增值尿素對水稻根系形態特征的影響Table 2 Effects of urea containing amino acid on rice root morphology

2.3 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤碳、氮含量的影響

如表3所示，稻作方式和氮肥種類對水稻根際土壤養分含量有明顯影響，影響程度因養分形態表現不一。與普通尿素相比，在旱作模式下，添加氨基酸增效劑尿素促進了根際養分積累，根際土壤有機碳、全氮和微生物氮分別增加了17.04%、18.18%和30.00%，C/N明顯下降，但銨態氮和硝態氮含量兩個處理之間差異不明顯；水作條件下，氨基酸增值尿素較普通尿素處理根際土壤銨態氮和微生物氮含量顯著增加，增幅分別為39.70%、38.01%，有機碳和全氮含量有增加趨勢，但處理間無顯著差異。水作方式下，水稻根際土壤硝態氮含量下降明顯，下降幅度達 33.70%；處理間C/N未見明顯差異。不同稻作方式對水稻根際無機氮的影響顯著，旱作根際硝態氮含量遠大于水作，銨態氮含量反之。兩種稻作模式下，施用尿素都明顯降低了土壤的pH。

表3 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤碳、氮含量的影響Table 3 Effects of urea containing amino acid on nitrogen in rice-cultivated soil under flooding and dry conditions

2.4 氨基酸增值尿素對水稻根際土壤相關微生物數量的影響

如表4所示，不同氮肥種類明顯影響根際土壤中與氮素轉化相關的微生物數量。與普通尿素比較，旱作和水作條件下氨基酸增值尿素處理根際土壤細菌總量分別增加 18.23% 和 22.93% (P＜ 0.05)，氨基酸添加表現出明顯激活土壤微生物效應，而稻作方式對根際細菌數量無顯著影響。與普通尿素處理相比，旱作和水作條件下氨基酸增值尿素處理根際土壤氨化細菌數量分別增加0.99和1.67倍，硝化細菌數量分別增加0.73和0.52倍。不同稻作方式下，氨基酸增效劑對根際氨化細菌和硝化細菌數量的影響差異明顯，水作條件下氨基酸增值尿素對氨化細菌激活效應明顯強于旱作條件下，SAU處理比GAU處理氨化細菌數量增加了28.29%，而未添加氨基酸增效劑的普通尿素處理GU與SU之間未見明顯差異；稻作方式同樣顯著影響氨基酸增效劑對根際硝化細菌數量的刺激效應，SAU處理硝化細菌數量明顯低于GAU處理，降幅達16.33%，水作條件下氨基酸增效劑對硝化細菌的刺激效應明顯減弱，同樣，未添加氨基酸增效劑的普通尿素處理GU與SU之間，硝化細菌數量未見明顯差異。

表4 不同處理水稻根際單位干土中細菌數量Table 4 Effects of urea containing amino acid on bacteria composition in rice-cultivated soil under flooding and dry conditions

2.5 水稻根際土壤細菌的群落組成

聚類分析結果 (圖1) 表明，旱作和水作細菌群落距離較遠，說明稻作方式對根際微生物群落有顯著影響。在屬分類水平上，列出平均相對豐度 ＞1%的類群，共得到10個類群 (圖1)。兩種稻作方式下，氨基酸增值尿素的施用都對水稻根際土壤細菌群落結構豐度產生顯著影響。旱作條件下主要優勢種群為：uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae和鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)，相對豐度分別為16.43%～23.47%、17.98%～20.53%和18.78%～22.59%；而水作條件下氣單胞菌屬 (Aeromonas) 和黃桿菌屬 (Flavobacterium) 為主要優勢種群，相對豐度分別為43.09%～52.72%和14.86%～18.87%。與普通尿素處理相比，水作氨基酸增值尿素處理根際氣單胞菌屬顯著降低了23.45%。旱作根際鞘氨醇單胞菌屬降低了22.23%，而uncultured_bacterium_c_Subgroup_6屬增加了18.75%，差異顯著。

圖1 不同施肥處理土壤細菌屬分類水平群落結構組成 (平均相對豐度 ＞ 1%)Fig. 1 The bacterial community structure at the genus classification level under different fertilizer application(Average relative abundance ＞ 1%)

2.6 水稻根際土壤細菌群落結構的主成分分析

圖2主成分分析結果表明，第一、第二主成分軸對細菌群落結構變異的解釋量分別為71.01%和19.72%。其中，兩種種植模式處理分析結果分別聚集在Y軸上下兩側，兩種稻作方式下土壤細菌群落結構差異明顯。不同稻作方式下施用氨基酸尿素肥料對土壤微生物產生明顯效應，與普通尿素處理相比，水作條件下細菌群落結構差異更加明顯。

圖2 不同處理下細菌群落結構的主成分分析Fig. 2 Principal components analysis of the bacterial community structure under different treatments

2.7 水稻根際土壤微生物群落和環境因子相關性分析

采用RDA方法分析細菌群落種類與土壤理化性質之間的關系，結果 (圖 3) 顯示，土壤 pH (P＜0.001)、全氮含量 (P＜ 0.001)、銨態氮含量 (P＜0.001) 和有機碳含量 (P＜ 0.001) 與微生物群落結構顯著相關。水作和旱作兩種種植方式下，氨基酸增效劑的添加主要是通過影響土壤銨態氮含量影響細菌群落結構，土壤氨化細菌數量與根際土壤銨態氮、有機碳、全氮等顯著相關；硝化細菌數量與根際硝態氮含量呈顯著相關，表明氨基酸增效劑的添加主要通過影響土壤銨態氮的含量進而影響土壤碳、氮轉化的根際微生物過程。

圖3 土壤微生物群落特征-土壤環境關系冗余分析Fig. 3 Redundancy analysis between soil properties and the bacterial community structure

3 討論

3.1 氨基酸增值尿素對不同稻作模式水稻生長與根系形態特征的影響

根系在植物生長發育過程中既是植株吸收水分和養分的主要器官，又是錨定植物支撐地上部正常形態的重要保證[20]。本研究結果表明，稻作方式和氮肥種類都對水稻根系生長和形態建成產生顯著影響。和普通尿素相比，氨基酸增值尿素對水稻根系生物量、根長、根直徑、根表面積和根尖數都表現出明顯的促進作用，兩種稻作模式對氨基酸的促根生長效應影響程度有所差異。從水稻根系鮮重看，盡管水作根系鮮重高于旱作，但氨基酸增值尿素較普通尿素處理的根系生物量增加百分率在旱作條件下高出水作2.09個百分點，由此可見旱作水稻上氨基酸增效劑添加較水作條件下的促根生長效應更加顯著。從根系形態特征看，兩種稻作模式下，氨基酸增值尿素均顯著增加了水稻的根長、根直徑、根表面積、根體積等形態指標數值，但旱作模式下，水稻根系對氨基酸添加劑的響應程度更明顯。同樣的氮肥種類，旱作根系形態指標均顯著低于水作，和普通尿素處理比較，氨基酸增值尿素明顯緩解了旱作對水稻根系生長的抑制效應，這為水稻旱作根系形態優化和水稻生育早期的水氮調控提供了有益的借鑒。這些結果與陳偉立等[21]通過控制水分和養分影響根系的生長發育狀況及生理特性的報道類似。

3.2 氨基酸增值尿素對不同稻作模式水稻根際養分特征的影響

進一步研究發現，氨基酸增值尿素與普通尿素對水稻根際土壤養分有顯著影響，稻作方式不同，氨基酸增值尿素表現出的效應有明顯差異。無論是旱作還是水作，氨基酸增值尿素均顯著增加了根際微生物氮，其原因可能是氨基酸增效劑在植物-土壤-微生物系統中，既能被植物吸收也能被微生物利用，微生物對氨基酸的高親和力使得其在吸收動力學和微時空上具有優勢[22]，再加上氨基酸的根系刺激效應，導致微生物大量繁殖，進而將尿素態氮轉化為微生物態氮保存在微生物體內，這種氮的微生物轉換機制可以保證氮素的持續供應[23]。水作條件下，氨基酸增效劑的添加，水稻根際土壤銨態氮含量顯著上升，而硝態氮含量明顯降低，水稻是典型的喜銨作物[24]，有研究表明銨態氮可以刺激水稻根系通氣組織的形成，提高氮素吸收率，從而增加氮素在植株體內的累積同化[25]，這種根際的高生物量氮、高比例銨和低比例硝的氮素形態分布，既有利于水作下的氮素吸收，也有利于水稻根際的氮素保蓄，可降低稻田硝態氮的淋洗損失風險。水稻旱作條件下，氨基酸增效劑對根際無機氮素形態影響不明顯，只是微生物氮較普通尿素處理顯著增加，這種增加效應小于氨基酸增效劑在水作條件下的效應，水作條件下，氨基酸增效劑較旱作條件下能更好的激活土壤微生物群落的固氮作用，有利于土壤對化肥氮的保持[23]。氨基酸的添加增加水稻生育早期根際土壤有效養分含量的原因，一是由于試驗所用復合氨基酸液富含多種小分子有機營養物質，與尿素熔融復合后可能會發生絡合、螯合或物理–化學吸附作用，減緩氮素化肥的溶解和轉化時間，使氮素釋放表現出一定緩釋性，提高了尿素態氮在土壤中的保蓄，增加氮肥有效供應時間，有利于作物對氮素的吸收利用[26–27]。二是作為小分子復合氨基酸與尿素復合施入土壤后，氨基酸可直接被作物吸收利用并參與代謝過程，節省了無機氮源正常代謝過程的能量消耗，促進植株生長和干物質積累[28–29]。另一方面，研究不同銨硝比對水稻生長的效應發現，低量銨硝比可以增加水稻秧苗根系中干物質量和根體積，有益于氮素吸收和增加水稻生物量[30–31]。本研究中，兩種稻作模式下，施用氨基酸增值尿素與施普通尿素相比均增加了根際土壤的銨硝比，這可能與氨基酸添加影響尿素在土壤中轉化有關，具體的機制有待深入研究。

3.3 氨基酸增值尿素對不同稻作模式水稻根際微生物菌群的影響

分析土壤根際細菌群落顯示，氨基酸增效劑添加能明顯改善施尿素條件下的根際土壤菌群結構。與普通尿素處理比較，水作條件下氨基酸增值尿素降低了氣單胞菌屬 (反硝化菌) 的數量，有利于減少硝態氮的反硝化脫氮損失，增加水作條件下的氮素保持。旱作條件下氨基酸增值尿素處理降低了鞘氨醇單胞菌屬 (反硝化菌) 的數量，除保持與水作條件下有利于氮素保持的共性外，鞘氨醇單胞菌屬還屬于一類致病菌，其數量減少降低了水稻根系的感染機會，有利于旱作條件下水稻根系健康環境的構成。旱作條件下土壤微生物種群以uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、Lysobacter和Sphingomonac為主，而水作條件優勢種群變為Aeromonas和Flavobacterium，也是水環境中普遍存在的兩類與魚病有關的固有細菌[32]。旱作氨基酸增效劑的添加能夠明顯降低可以引起根部傷口感染的微生物Sphingomonas菌群數量，利于根際土壤菌群健康發育。而水作氨基酸增值尿素處理可以顯著降低Aeromonas和Flavobacterium兩種菌群所占比例，促進了稻田健康菌群系統形成[33]。有研究表明土壤氮循環與微生物群落結構多樣性存在顯著相關性[34]，與普通尿素處理比較，氨基酸增效劑添加明顯增加水作氨化細菌數量和旱作硝化細菌數量，這與氨基酸有利于功能型微生物氨化細菌、硝化細菌的繁殖有關[35]。冗余分析結果表明，硝化細菌和氨化細菌分別是影響根際土壤硝態氮和銨態氮含量的最主要因素，土壤中這兩類菌群的增加可以強化根系脫落物或者植株殘留等有機物質的分解，優化植物根際的氮素供應，從而提高植株生物量[36]。

4 結論

氨基酸增值尿素在淹水和旱作條件下，均可顯著促進水稻根系生長和根系形態建成，淹水條件下的效果好于旱作。旱作條件下，氨基酸增值尿素較普通尿素增加了根際生物量碳、氮，增強了根際土壤氮素的生物保蓄能力，可更有效減輕旱作對水稻根系生長的抑制效應；在水作條件下，氨基酸增值尿素能夠明顯降低根際硝態氮含量，提高銨態氮含量，有利于水稻的氮素吸收。與普通尿素相比，氨基酸增值尿素可顯著增加氨化細菌、硝化細菌和細菌總數量，增加根際微生物多樣性和改善優勢菌群，有利于水稻根際健康菌落的建成。