玉米秸稈分解過程中細菌群落組成演化特征

王西亞，呂繼龍，何 萍，范分良，仇少君，徐新朋，趙士誠

（農業農村部植物營養與肥料重點實驗室/中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

作物秸稈富含有機碳和礦質養分，是重要的有機肥資源。我國近年農田秸稈產量超過8億t[1]，養分還田潛力巨大。秸稈還田可提高土壤肥力、增加有機碳固持和維持農田可持續生產能力[2]，因此秸稈還田對我國的土壤培肥和化肥減施意義重大。

秸稈分解是一個由土壤微生物調控的有機碳礦化和養分釋放的過程，所有影響微生物活性的因素均可影響秸稈的分解，如秸稈化學組成、土壤養分和C/N、水熱條件等[3-4]。以前研究報道細菌主導秸稈前期易分解組分如蛋白質、纖維素等的分解，而真菌主導后期難分解組分如木質素等的分解[5-6]；而其他研究發現細菌Actinobacteria、Firmicutes和Proteobacteria門在玉米秸稈分解過程中起重要作用[5]，細菌Bacilli屬只出現在秸稈分解前期，而Actinobacteria在整個分解過程中均保持較高豐度[6]，即細菌在秸稈整個分解過程中都起著重要作用。不同微生物組分對秸稈組分表現出不同的分解功能，如Herzog等[7]發現秸稈分解前期以快速循環微生物Bacteroidetes和Helotiales為主，隨后被Acidobacteria和Pleosporales等代替，因此秸稈分解過程也是其微生物群落組成的演化過程。秸稈分解中的微生物來源包括秸稈和土壤，Stone發現有些微生物組分在作物成熟衰老期已存在于作物秸稈和葉片表面并在隨后的秸稈分解中起重要作用[8]。秸稈的碳氮比一般高于土壤，而土壤對于微生物的生長一般是限碳的[9]，土壤微生物為得到有機碳而向秸稈移殖，因此土壤微生物的移殖促進秸稈內微生物的生長及對秸稈的同化分解[10]。然而，區域土壤理化性狀的變異導致其微生物群落組成差異較大[4]，不同區域秸稈分解過程中來自秸稈和土壤的微生物組成在秸稈分解過程中的演化特征也不一致。

華北地區是我國主要糧食產區之一，近年已基本實現作物秸稈全量直接還田，是我國秸稈直接還田比例最高的地區[11]。當前針對華北地區秸稈分解速率與秸稈中細菌群落組成演化的研究相對較少。本研究在河南省潮土區設置一年的基于秸稈包的田間秸稈分解試驗，不定期取樣分析秸稈過程中生物量、養分含量和秸稈、土壤細菌群落組成的變化，探究玉米秸稈分解過程中細菌群落組成的演化特征，為調控土壤微生物群落組成以促進還田秸稈分解的研究和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

秸稈分解試驗于2014年10月至2015年10月在河南省農業科學院原陽試驗基地 (34°47′N，113°40′E) 進行。該地區為暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，以冬小麥–夏玉米輪作為主要種植模式，年平均溫度和降水量分別為14.3℃和632 mm，約70%～80%的年降水集中于夏玉米季，試驗期間的月平均溫度和降水量如圖1所示。試驗點土壤為砂壤質潮土，其理化性狀如下：pH 8.7 (水∶土壤為2.5∶1)、有機碳 5.2 g/kg、全氮 0.46 g/kg、全磷 0.65 g/kg、全鉀 16.9 g/kg、礦質態氮 (硝態氮+銨態氮) 56.4 mg/kg、有效磷 16.1 mg/kg、交換性鉀 89.4 mg/kg。

圖1 試驗期間試驗點氣溫和降雨量變化Fig. 1 Air temperature and precipitation of the experimental site

1.2 試驗設計

于2014年9月夏玉米收獲期，從田間收集玉米秸稈 (包括莖和葉)，將秸稈在 65℃下烘干后剪切成長 1～2 cm、寬 0.3～1 cm 的碎片，并將 12 g 秸稈(相當于 8 t/hm2) 放入 15 cm × 10 cm 尼龍網包 (孔徑0.04 mm)內。于10月5日，將36個秸稈包埋在兩行冬小麥的中間 (深度 12 cm、包間距 20 cm)，冬小麥收獲后免耕并直播夏玉米。整個小麥和玉米生長季內不施用任何肥料以避免其對秸稈養分測定的影響。

1.3 樣品的采集與測定

1.3.1 秸稈包和土壤樣品采集 分別于埋放后0、1、2、4、7、10和12個月各收集6個秸稈包，用刷子將秸稈包外附著的土壤顆粒及土壤動物等異物刷掉，然后將秸稈包放入冰盒并立即運至實驗室。將3個秸稈包放入烘箱中65℃烘至恒重后測定干物質量和養分含量，另外3個秸稈包保存在超低溫冰箱中 (–70℃) 用于細菌群落組成測定。在收取秸稈包的同時 (除第 2 月) 收集秸稈包周圍 5～10 cm 處土壤樣品20 g，與秸稈包一起放入冰盒運至實驗室，撿出砂礫、作物根系等過篩后存于超低溫冰箱，用于細菌群落結構測定。

1.3.2 秸稈生物量和養分含量的測定 將烘干的秸稈樣用球磨儀 (Retsch MM200，德國) 研磨，用秸稈碳、氮元素分析儀 (CN型，德國) 測定，原始秸稈有機碳含量426.2 g/kg、全氮含量9.3 g/kg。取各時期粉碎的秸稈樣0.5 g放入馬弗爐550℃ 煅燒8 h后測定灰分含量，根據不同取樣期秸稈樣品與原始秸稈灰分重量差異來矯正土壤污染對秸稈生物量的影響[12]。

1.3.3 秸稈及土樣細菌群落的測定 選取原始秸稈和埋入土壤中第2、4、7、12個月的秸稈樣品及試驗初始和埋入秸稈4、7、12個月的土壤樣品，提取總微生物DNA。稱取0.2 g秸稈殘渣或土壤樣品，使用 FastDNA?SPIN 試劑盒 (MP Biomedicals，Illkirch，法國)，從中提取微生物DNA。使用Ultra-Clean DNA 純化試劑盒 (MoBio，Carlsbad，CA，美國) 純化提取的DNA，然后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查。定量 PCR分析：使用SYBR Green I在iCycler系統 (美國) 中定量細菌 16S rRNA 基因拷貝的豐度，并通過Bio-Rad iQ5 v2.0分析結果。PCR反應體系 (20 μL) 包含 2 × 10 Super Mix (Bio-Rad，美國)、10 μmol/L 的引物 (515F 和 806R) 和 1 μL 的1/10稀釋DNA。PCR采用以下熱循環程序：95℃ 預變性 1 min，94℃ 變性 15 s，55℃ 退火 34 s，72℃延伸15 s，共40個循環。用含有細菌DNA的質粒稀釋成不同梯度制作反應標準曲線用于計算各樣品細菌豐度，標準曲線的相關性系數大于0.99。定量PCR反應每樣品設置4個重復。細菌16S rRNA的擴增和測序：細菌16SrRNA基因的V3–V4區使用引物338F (5'–barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3') 和 806R (5'–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3')進行 PCR 擴增 (95℃ 預變性 2 min；95℃ 變性 30 s，56℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 60 s，30 個循環；72℃ 進行5 min的最終延伸)，barcode為一八堿基序列[13]。PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠回收，用AxyPrep DNA 純化試劑盒 (Axygen Biosciences，Union City，CA，美國) 純化，并用 QuantiFluorTM-ST (Promega，美國) 進行定量。將純化的PCR產物交由上海美吉生物科技有限公司使用IlluminaMiSeq平臺進行高通量測序。然后采用QIIME (V1.17) 對原始序列進行質量控制和加工處理，在質量控制后，每個樣品的細菌總數為33968～66495個，平均長度為437 bp。為了避免由測序深度差異導致的偏差，每樣品隨機選擇33480個子樣本read抽平后用于細菌多樣性和群落組成分析。使用UPARSE (V7.1) 將OTUs按照97%的相似性歸類，并使用UCHIME鑒定并去除嵌合序列。利用Silva數據庫對每個16S rRNA基因序列的分類進行分析。使用Mothur軟件計算Shannon和Simpson多樣性指數，以及Chao1和ACE豐度，以估計細菌的多樣性和豐度。將結果存入NCBI數據庫 (登錄號：PRJNA623251)。

1.4 數據統計分析

用SPSS 19.0統計軟件對不同時期秸稈干物質量和碳氮比、秸稈和土壤中細菌豐度、各組分的相對豐度和多樣性的差異進行單因素分析，并通過Tukey顯著差異法分析樣品間顯著性 (P＜ 0.05)。用Minitab 16.0進行主成分分析評估細菌群落組成的β多樣性，用Canoco 5.0軟件進行冗余分析評價秸稈理化特征和環境因子對秸稈細菌群落組成變化的影響。

2 結果與分析

2.1 秸稈分解過程中生物量和碳氮比變化

秸稈生物量殘留率隨試驗時間的增加逐步降低，秸稈埋放后的1、2、4、7、10和12月后的秸稈殘留率分別為80.8%、67.1%、55.8%、47.8%、33.2%和26.2%，其中秸稈在前兩個月的分解速率最快 (圖2)。秸稈C/N在埋放1個月后顯著增加，然后隨試驗時間延長而逐漸下降，秸稈分解前7個月內的C/N均高于原始秸稈 (埋放前秸稈，C/N 45.8)，第12個月C/N較初始值降低了7.4。

圖2 秸稈生物量和碳氮比隨分解時間的變化Fig. 2 Dynamics of straw biomass and C/N ratio during decomposition period

2.2 秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌豐度變化

秸稈埋入土壤后，秸稈細菌豐度顯著增加并在第4個月達到最高，然后開始逐步降低 (圖3)。試驗過程中土壤細菌豐度的變化趨勢與秸稈中相似，第7個月時達最高后開始降低，而同時期土壤細菌的豐度高于秸稈中。

圖3 秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌豐度變化Fig. 3 Dynamics of bacterial abundance of straw and soil during straw decomposition process

2.3 秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌α-多樣性

秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌α-多樣性指標如表1所示。秸稈埋入土壤2月后，秸稈中細菌的OTUs、ACE、Chao1和Shannon指數均顯著增加，且隨試驗時間的增加逐步增加，而Simpson指數隨試驗時間的增加而逐步降低。土壤細菌的OTUs和多樣性指標ACE、Chao1、Shannon和Simpson指數在試驗過程中沒有顯著變化。對比發現，同時期土壤中細菌的OTUs數目和組成多樣性明顯高于秸稈細菌OTUs和多樣性。

表1 秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌群落的α-多樣性指數Table 1 α-Diversity indexes of bacterial communities in straw and soil during decomposition process

2.4 秸稈分解過程中秸稈細菌β-多樣性變化及環境因子對多樣性組成影響

根據主成分分析結果，第一和第二主成分分別解釋了秸稈細菌群落門水平總變異的48.1%和20.3%(圖4A)。起始秸稈細菌群落組成在第二主成分軸與其他時期的細菌組成明顯分離，從第2月起，秸稈細菌群落組成沿第一主成分軸由負軸向正軸延伸分布，且第12月的細菌群落組成與其他時期明顯分離。起始秸稈樣中細菌組成由Proteobacteria主導，埋放后2～7個月由Bacteroidetes主導，而12個月后，Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria 和Gemmatimonadetes主導作用明顯增加。在綱水平，第一和第二主成分分別解釋了秸稈細菌群落總變異的52.9%和25.2% (圖4B)，不同時期秸稈細菌綱組分在第一、二主成分的分布與門組分相似。起始秸稈中細菌綱組分由Gammaproteobacteria主導，埋放后第2～7個月由Betaproteobacteria、Sphingobacteriia和Flavobacteriia主導，而第12個月后，Acidobacteria、Spartobacteria、Deltaproteobacteria、Bacilli和Anaerolineae等組分主導作用明顯增加。

圖4 秸稈分解不同時間細菌群落組成門水平 (A) 和綱水平 (B) 的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of straw bacterial community composition at phylum (A) and class (B) levels in different decomposition months

冗余分析顯示，秸稈分解前期 (2個月) 的細菌群落組成在門和綱水平均與秸稈有機碳和水分含量相關性較高，4個月后的群落組成與秸稈C/N相關，7個月后與溫度相關性較高，而在12個月后受秸稈氮含量影響較大。說明有機碳含量和水分是影響秸稈前期分解的重要因素 (圖5)。

圖5 對秸稈分解過程中細菌群落組成和秸稈理化性狀的冗余分析Fig. 5 Redundancy analysis of bacterial community composition and physicochemical characteristics of straw in different decomposition months

2.5 秸稈碳氮含量、環境因子、細菌豐度和多樣性與秸稈分解速率的關系

相關分析顯示，秸稈C/N和有機碳含量與秸稈分解速率正相關 (r= 0.5)，且秸稈C與其分解速率顯著相關 (r= 731，P＜ 0.05)，而秸稈氮含量、溫度、含水量，及微生物豐富度、多樣性因子與秸稈分解速率均呈負相關，相關系數分別為–0.180、–0.505、–0.454、–0.036、–0.742。

2.6 秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌各組分相對豐度的變化

細菌群落主要由12個門組成 (相對豐度 ＞ 1%，圖 6)，以 Proteobacteria (變形菌門) 豐度最高，占樣品細菌總豐度的40.2%～66.5%，其次為Actinobacteria(放線菌門，5.25%～27.1%)、Bacteroidetes (擬桿菌門，11.1%～40.0%)、Firmicutes (厚壁菌門，1.9%～6.5%)、Chloroflexi (綠彎菌門，0.6%～12.2%)、Saccharibacteria (TM7 門，1.0%～21.1%)、Acidobacteria (酸桿菌門，0.2%～5.0%)、Verrucomicrobia(疣微菌門，0.5%～2.9%)、Planctomycetes (浮霉菌門，0.3%～3.6%)、Gemmatimonadetes (芽單胞菌門，0.1%～2.3%)、Latescibacteria (WS3 門，0.05%～1.5%) 和 Nitrospirae(硝化螺旋菌門，0.02%～1.3%)。土壤中也以變形菌門豐度最高 (31.1%～32.8%)，其次為放線菌門(14.7%～16.6%)。秸稈埋入土壤后，秸稈Proteobacteria門豐度隨試驗時間延長逐步降低；Actinobacteria豐度在秸稈埋入土壤初期明顯降低，然后隨試驗時間的增加逐步增加；Bacteroidetes豐度在秸稈埋入土壤初期明顯增加，然后隨試驗時間延長逐步降低；Chloroflexi、Saccharibacteria 和 Acidobacteri門的豐度均隨試驗時間的增加逐步增加。Verrucomicrobia、Planctomycetes和Gemmatimonadetes門在秸稈埋入土中前沒有檢測到，它們在秸稈埋入土壤后出現且其豐度隨試驗時間的延長逐步增加，說明這些細菌組分是由土壤移殖于秸稈。在土壤中，Chloroflexi和Acidobacteria門的相對豐度顯著高于Bacteroidetes，且細菌所有組分門的相對豐度在試驗過程中沒有顯著變化。

圖6 秸稈分解過程中秸稈和土壤中細菌各門和綱組分的相對豐度變化Fig. 6 Change in relative abundance of bacterial fractions in both straw and soil in different straw decomposition months

在綱水平，秸稈中豐度最高的細菌綱組分為Gammaproteobacteria (γ-變形菌綱)，豐度占樣品所有組分的 10.6%～48.5%，然后依次為Alphaproteobacteria(α-變形菌綱，14.7%～22.4%)，Actinobacteria (放線菌綱，3.3%～27.2%)，Sphingobacteriia (鞘脂桿菌綱，0.7%～27.4%)，Flavobacteriia (黃桿菌綱，0.3%～19.6%)，Betaproteobacteria (β-變形菌綱，2.0%～5.9%)，Bacilli (芽孢桿菌綱，0.7%～4.5%)，Cytophagia(噬纖維菌綱，1.0%～3.8%)，Deltaproteobacteria (δ-變形菌綱，0.2%～4.4%)，Saccharibacteria (螺旋體菌綱，0.07%～3.3%)，Anaerolineae (0.1%～4.9%)和Acidobacteria (酸桿菌綱，0.2%～16.5%)。土壤中以Actinobacteria (15.4%～15.8%) 豐度最高，其次為Acidobacteria (14.4%～14.6%)，Alphaproteobacteria(10.4%～10.7%)，Anaerolineae (6.5%～6.9%)，Gammaproteobacteria (6.6%～7.1%)，Betaproteobacteria(5.1%～5.6%)，Gemmatimonadetes (4.5%～5.1%)，Sphingobacteriia (4.6%～4.6%)，Chloroflexia(3.3%～3.5%)，Saccharibacteria (2.6%～3.3%) 和Cytophagia (2.2%～2.5%)。

玉米秸稈在埋入土壤后，Alphaproteobacteria、Acidobacteria和Deltaproteobacteria綱的豐度隨試驗時間的延長逐漸增加，12個月后達最高，而Gammaproteobacteria豐度隨試驗時間的延長逐漸降低。Actinobacteria和Bacilli在秸稈埋入土壤后初期豐度明顯降低，然后又隨著試驗時間的延長逐漸增加；其中，Sphingobacteriia、Flavobacteriia和Betaproteobacteria組分在試驗起始階段明顯增加，然后隨試驗時間延長逐步降低。土壤各綱組分相對豐度在試驗過程中沒有明顯變化，秸稈中綱群落組成隨試驗時間延長與土壤中的綱群落組成逐步趨同。

3 討論

3.1 秸稈分解速率與秸稈碳氮含量、環境因子、細菌豐度和多樣性的關系

秸稈分解過程主要包括快速和緩慢分解階段[14]。本研究中秸稈前2個月的分解速率最高，隨后逐步降低，這與前人[15-16]研究的秸稈分解前期快、后期慢的結果一致。因為微生物首先同化分解秸稈易分解組分，易分解組分耗盡后才會去分解難分解組分，而秸稈化學組成是影響其分解速率的重要因素[17-18]。本研究中也發現，分解前期主要是分解葉片等易分解組分。Kamble等[9]發現，細菌在土壤中的生長主要受有機碳限制，添加有機碳可促進細菌的生長。本研究中所用玉米秸稈C/N (45.8) 顯著高于土壤C/N(11.3)，秸稈能提供較多的有機碳，土壤能為微生物生長提供適宜的水分和溫度，因此埋入土壤后秸稈內細菌獲得充足的碳源和養分后活性迅速增加，進而增殖而顯著增加了豐度，提高了對秸稈碳的同化和分解。相關分析也說明，秸稈分解受其碳含量影響最大。因為分解前期秸稈易分解組分的有機碳含量高于難分解組分，分解后期秸稈以難分解組分為主，其有機碳含量也逐步降低[19]。作為秸稈的主要分解者，微生物的豐度、活性和群落組成均可顯著影響秸稈分解速率[3]，以前的研究表明不同施肥處理土壤主要通過增加微生物豐度來促進秸稈分解[20-21]。秸稈分解速率顯著降低后 (2個月后) 微生物豐度仍繼續增加，類似現象在以前的研究[20]也已發現，可能因為微生物量的消減變化較秸稈生物量變化具有一定滯后性，同時夏季的高溫有助于微生物的生長。秸稈埋入土壤后，土壤微生物為獲得有機碳而逐步向秸稈移植導致秸稈內細菌組成多樣性逐步增加，而相關分析顯示秸稈分解速率與細菌組成多樣性呈顯著負相關，一方面因為秸稈易分解組分在前期被大量分解而分解速率降低，另一方面因為大量微生物組分具有相似的分解功能并占據著相同的生態位，其功能的冗余導致群落多樣性增加而并沒有增加秸稈分解速率[7]。溫度和水分均是影響秸稈分解的重要因素，而本研究中秸稈分解速率與其溫度和水分相關不顯著，因為前期易變組分的分解對溫度變化不敏感[22]，中后期 (夏秋季) 難分解組分分解過程中本區域溫度和水分均不是限制因素。

秸稈C/N與其分解速率相關性沒有達到顯著水平，其較高的相關性也說明秸稈C/N可影響秸稈分解速率。楊志謙等[23]發現秸稈碳氮比對其分解有一定的影響，且秸稈碳氮比的變化只影響作物秸稈初期的分解，與本研究秸稈分解初期碳氮比升高促使秸稈分解速率較快的結果相一致。

3.2 秸稈分解過程中細菌菌群組成的演化特征

原始秸稈中Proteobacteria和Actinobacteria門主導細菌群落組成 (＞ 93%)。秸稈埋入土壤初期，Bacteroidetes、Firmicutes和Proteobacteria門主導秸稈細菌群落組成，因為這3個細菌門均為富營養型菌 (r-型)，主要在早期對秸稈富含養分的易降解組分進行分解[24]。Actinobacteria豐度在初期顯著降低，然后隨試驗時間的延長而增加；Chloroflexi、Saccharibacteria和Acidobacteria門在原始秸稈中豐度極低，在秸稈埋入土壤后4～7個月開始顯著增加，因為這些細菌屬于貧營養型菌 (k-型)[24]，主導秸稈中后期貧營養、難分解組分的降解。Bastian等[25]和Sun等[26]發現，作物秸稈分解過程中微生物群落組成經歷一個營養狀態由飽和到耗竭的演替過程，秸稈分解早期主要由富營養菌群控制，隨著秸稈質量的下降，貧營養菌群相對豐度增加而主導中后期秸稈的分解。Blaud等[27]探究稻草分解過程中細菌群落動態變化時發現，秸稈降解早期階段革蘭氏陰性細菌更重要，本研究秸稈中Proteobacteria門 (屬革蘭氏陰性細菌) 在試驗初期的相對豐度較高和秸稈分解初期分解速率較高保持一致，可見變形菌門對前期秸稈分解影響較大。Fan等[5]發現玉米秸稈分解時Proteobacteria門在分解前期，Acidobacteria門在分解后期起重要作用。

秸稈埋入土壤后，Actinobacteria和Anaerolineae綱細菌豐度變化分別與Actinobacteria和Chloroflexi門相似。Gammaproteobacteria綱豐度變化與Proteobacteria門相似，而Alphaproteobacteria和Deltaproteobacteria的豐度在分解過程中逐步增加。Sphingobacteriia和Flavobacteriia綱表現出與Bacteroidetes門相似的變化，而Cytophagia豐度卻隨試驗時間延長逐步增加。說明Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria和Chloroflexi門的代謝功能由綱Sphingobacteriia和 Flavobacteriia、Actinobacteria和 Anaerolineae主導。秸稈分解過程中Alpha-、Beta-、Delta-Gammaproteobacteria豐度的不同變化，說明細菌同門下的不同綱在秸稈分解不同階段具有不同的功能。如Gammaproteobacteria被認為是富營養型菌，而Deltaproteobacteria則被認為是貧營養型菌[25]。Sun等[26]認為Deltaproteobacteria和Acidobacteria在秸稈分解后期主導而具有貧營養型菌特征。根據冗余分析結果，秸稈分解早期主要受秸稈有機碳和水分含量影響，而分解后期與氮含量相關性較高，說明秸稈分解過程中細菌群落組成的演化主要受秸稈碳氮變化所驅動，即秸稈中易分解組分比例的降低和難分解組分比例的增加導致細菌組分由富營養型向貧營養型演化。

4 結論

玉米秸稈在還田后的前兩個月分解速率較快，隨后逐步減慢，周年分解率約為73.8%。在秸稈分解前期細菌群落由Proteobacteria、Bacteroidetes門和Gammaproteobacteria、Sphingobacteriia、Flavobacteriia和Alphaproteobacteria綱主導，后期由Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Saccharibacteria 門和Deltaproteobacteria、Actinobacteria綱等主導。秸稈碳氮含量變化是影響秸稈分解過程中細菌群落演化的主要原因。