施氮水平對富士蘋果果實鈣形態及品質的影響

張艷珍，程存剛，趙德英，周江濤，陳艷輝，張海棠，解 斌

（中國農業科學院果樹研究所/遼寧省落葉果樹礦質營養與肥料高效利用重點實驗室/農業農村部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧興城 125100）

‘富士’蘋果作為我國的主栽品種，其栽培面積約占我國蘋果種植面積的70%以上[1]。近些年隨著人民生活水平的日益提高，人們對蘋果果實品質的要求也越來越高[2]。鈣在果實品質形成過程中起重要作用，甚至超過了氮、磷、鉀等元素[3]。大量研究表明，果實內適量的鈣含量能提高果實硬度、果實總糖和維生素C含量，同時降低果實可滴定酸含量[4-7]。果實中鈣含量不足，會增大果實生理失調 (苦痘病、水心病等) 發生幾率[8-10]。鈣在果實內主要以水溶性鈣、果膠酸鈣、磷酸鈣、草酸鈣和殘渣鈣的形式存在[11]。果實品質的形成與保持不僅與果實總鈣含量有關，還與不同形態鈣含量有關[12-13]。不同形態的鈣在植物體內具有不同的功能，且在一定的生理環境條件下可相互轉化[14]。

氮是植物需求量最大的必需營養元素之一。氮可影響鈣的吸收，從而改變果實內鈣含量，影響果實品質[15]。供氮不足或過量均會影響果樹對鈣的吸收[8]，降低果實品質[16]。有研究表明，供氮不足導致果實內鈣含量減少，果實品質變差；氮肥過多時，鈣離子和銨離子產生拮抗作用，阻礙鈣離子正常吸收[17-18]。前人研究主要集中在鈣肥種類[19-20]、施鈣方式[21-22]、施鈣量和施鈣時期[23]對果實品質及不同形態鈣的影響方面，而施氮量對富士蘋果果實內不同形態鈣的影響，以及各形態鈣在果實品質形成中的作用研究較少。

因此，研究不同施氮量下富士蘋果果實內各形態鈣的變化趨勢，及其與果實品質指標變化的相關性，明確不同形態鈣對果實品質的影響程度及影響方式，以便通過調整氮肥施用量，調控果實中某種形態鈣的比例，實現改善果實品質的目的，進而為蘋果氮肥合理施用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年4—12月在中國農業科學院果樹研究所進行。以5年生盆栽富士 (Malus domesticaBorkh cv. Fuji) 為試材，基砧為組培山定子，中間砧為SH38，每株果25個左右。營養缽尺寸為上口徑36 cm、下口徑 32 cm、高 29 cm，土壤重量 30 kg。土壤pH為7.1、有機質含量11.5 g/kg、堿解氮含量86.3 mg/kg、有效磷含量 57.5 mg/kg、速效鉀含量138.7 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗共設置6個施氮 (N) 水平，分別為0、50、100、200、300、400 kg/hm2，折合每盆尿素用量分別為 0、1.48、2.96、5.93、8.89 和 11.86 g，依次記為 N0、N50、N100、N200、N300和 N400處理。同時按施鈣 (Ca) 200 kg/hm2計，折合無水氯化鈣為每盆 7.58 g。所用氮肥為尿素 (N 46%)，鈣肥為無水氯化鈣 (分析純)。每個處理選取長勢一致的植株6株，單株小區，6次重復。肥料等分為3次施入，花后7天開始施肥，每7天施1次。肥料溶于1 L水中，采用施肥袋進行施肥，滴速為250 mL/h。其他管理水平為常規管理。

1.3 樣品采集及測定

1.3.1 樣品采集與處理 果實成熟期，每個處理隨機采集樹冠外圍中部，大小均勻的果實50個。將10個果實洗凈切片混勻，105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，粉碎后過80目篩于自封袋保存，用于總鈣含量測定；將10個果取皮下果肉，經液氮冷凍后于-80℃冰箱中保存，用于測定不同形態鈣；另外30個果實則10個果為一個重復，測定果實品質。

1.3.2 果實鈣含量測定 樣品經H2O2-H2SO4法[24]消煮后，用原子吸收分光光度計 (ZEEnit700P，德國)測定總鈣含量。根據總鈣含量 (FW)/(1 – 果實含水量) = 總鈣含量 (DW)，計算果實總鈣含量 (FW)。

采用逐級提取法提取[25]果實中各形態鈣，浸提液依次為去離子水、1 mol/L NaCl、2% HAc 和 5%HCl，提取液的主要組分分別為水溶性鈣 (H2O-Ca)、果膠酸鈣 (NaCl-Ca)、磷酸鈣 (HAc-Ca)、草酸鈣(HCl-Ca)。原子吸收分光光度計測定各提取液中鈣含量。

1.3.3 果實品質測定 于果實成熟期采樣，每個處理隨機采集樹冠外圍中部大小均勻的果實30個，10個果為一個重復，共3次重復。用色差儀 (NR145，中國) 測量果皮的色澤參數。用IP67型數顯卡尺測量果實縱橫徑，果形指數用果實縱徑與橫徑的比值表示。使用TA-HDplus物性分析儀測定果實硬度；使用PAL-1手持測糖儀測定可溶性固形物含量；采用酸堿滴定法測定可滴定酸含量，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量，采用2,6-二氯靛酚滴定法測定維生素C含量。

1.4 數據處理及統計分析

使用 Microsoft Excel 2016 軟件進行數據處理，使用SAS 9.4進行方差分析和相關性分析。

2009年，微量物質示蹤技術在綏中油田[14]進行了應用，現場試驗表明微量物質示蹤劑具有用量少、檢測精度高、對環境無污染等優點。隨后大港油田[15]也取得了良好的現場使用效果。

廣義線性模型 (generalized linear model，GLM)可以應用于非線性或非恒定方差結果的數據中，因此參照叢金鑫[26]的方法，采用R3.6.3軟件平臺，通過廣義線性模型 (GLM) 建立不同形態鈣與果實品質指標之間的關系，使用矯正的AIC進行模型檢驗，選出最佳擬合模型，同時通過MuMIn程序包的dregre函數，分析不同形態鈣對果實品質指標的影響程度及影響方式。

2 結果與分析

2.1 施氮量對果實總鈣及不同形態鈣含量的影響

施氮可顯著影響果實鈣含量及各形態鈣的組成比例(表1）。富士蘋果果實中總鈣含量隨施氮量的增加呈先升高后降低的趨勢，N200處理果實總鈣含量顯著高于其他處理和對照，但N300與N400處理之間無顯著差異。施氮量由低到高各施氮處理的總鈣含量比N0分別增加了21.02%、59.14%、73.47%、42.99%和41.60%。施氮可增加果實中水溶性鈣(H2O-Ca)、果膠酸鈣 (NaCl-Ca)、磷酸鈣 (HAc-Ca) 含量。除N50處理的H2O-Ca和N400處理的草酸鈣 (HCl-Ca) 外，各施氮處理果實中的4種形態鈣均與N0之間存在顯著差異。H2O-Ca、NaCl-Ca、HAc-Ca和HCl-Ca分別在N400、N200、N100、N200處理時含量最高，比對照N0處理分別增加了138.31%、87.25%、34.49%、59.35%。

表1 不同施氮水平下果實總鈣及不同形態鈣含量 (mg/kg, FW)Table 1 Total Ca and different forms of Ca content of fruits at different nitrogen levels

隨施氮量的增加，果實中不同形態鈣的組成比例發生了變化，其中H2O-Ca、NaCl-Ca、HAc-Ca變化幅度較大 (圖1)。H2O-Ca隨施氮量的增加比例整體呈上升趨勢，在N400處理中占果實中總鈣含量的44.13%，比N0處理中的占比增加了15.70%，在N200處理中占果實中總鈣含量的32.58%，比N0處理中的占比增加了6.95%；NaCl-Ca隨施氮量的增加變化趨勢不明顯，在N50與N200處理時分別占果實中總鈣含量的43.15%和42.88%，分別比N0處理中占比增加了3.43%和3.15%；HAc-Ca所占比例隨施氮量的增加呈先降低后升高趨勢，在N200處理時占比最小，為果實中總鈣含量的12.03%；HCl-Ca和殘余鈣(Res-Ca) 變化范圍較小，占果實中總鈣含量的比例分別為5%～8%和4%～7%。

圖1 不同施氮水平下果實中不同形態鈣的組成比例Fig. 1 Proportions of different forms of calcium in fruit at different nitrogen levels

2.2 不同施氮量下富士蘋果果實中不同形態鈣之間的關系

圖2右上方為總鈣含量和其余鈣含量的相關系數，左下方為一種鈣形態的鈣含量隨其余鈣的增加而呈現的增加或者減少情況。圖2顯示，果實中4種形態鈣均與總鈣含量呈正相關，其中H2O-Ca、NaCl-Ca與總鈣 (Total-Ca) 含量呈極顯著正相關，相關系數分別為0.85和0.86，HCl-Ca與Total-Ca含量呈顯著相關，相關系數為0.63。不同形態鈣之間也存在一定的相關性，表現為：NaCl-Ca與HCl-Ca的含量呈極顯著正相關，相關系數達0.74；H2O-Ca與NaCl-Ca、HAc-Ca和HCl-Ca均呈正相關，相關系數分別為0.46、0.07和0.32。而HAc-Ca與HCl-Ca呈負相關，相關系數為–0.066。

圖2 不同施氮水平下果實中不同形態鈣的相關系數及分布關系Fig. 2 Correlation coefficients and distribution of different forms of calcium in fruit at different nitrogen levels

c通過果實內不同形態鈣的分布圖可以發現，隨著H2O-Ca含量的增加，其他3種形態鈣均呈先上升后下降的趨勢。H2O-Ca含量為35 mg/kg時，其他3種形態鈣含量均最高，隨H2O-Ca繼續增加，其他形態鈣含量均出現明顯下降趨勢。HAc-Ca含量隨NaCl-Ca含量的增加呈先上升后下降的趨勢，NaCl-Ca含量為40 mg/kg時，HAc-Ca含量最高，隨NaCl-Ca含量繼續增加，HAc-Ca含量明顯下降；HCl-Ca含量隨NaCl-Ca含量的增加呈先上升后下降的趨勢，當NaCl-Ca含量為30～35 mg/kg時，HCl-Ca含量最低，且隨著NaCl-Ca含量繼續增加，HCl-Ca含量明顯上升。隨HAc-Ca含量的增加，HCl-Ca含量波動較小，總體呈先下降后上升的趨勢，HAc-Ca含量為13～15 mg/kg時，HCl-Ca含量最低。

2.3 果實品質指標間的相關性

果實品質形成是一個極其復雜的過程，各品質指標間關系密切。由表2可以看出，10個指標中共有 16對指標間|r| ＞ 0.7，表現出高度相關性[27]，且相關系數達到極顯著水平 (P＜ 0.01)。其中，與果形指數 (FSI) 表現出高度相關的指標有3個，分別是黃藍色差 (b)、果實硬度 (FF)、可溶性糖 (SSC)；與果皮亮度 (L) 表現出高度相關的指標有3個，分別是紅綠色差 (a)、可溶性固形物 (TSS)、SSC；與a表現出高度相關的指標有5個，分別為L、FF、TSS、SSC、維生素C (Vc)；與b表現出高度相關的指標有3個，分別為FSI、FF、可滴定酸 (TA)；與FF表現出高度相關的指標有5個，分別為FSI、a、b、TA、SSC；與TSS表現出高度相關的指標有4個，分別為L、a、SSC、Vc；與SSC表現出高度相關的指標有5個，分別為FSI、L、a、FF、TSS；與TA表現出高度相關的指標有2個，分別為b、FF；與Vc表現出高度相關的指標有2個，分別為a、TSS。

表2 果實品質指標間的相關系數 (r)Table 2 Correlation coefficients among fruit quality indicators

2.4 施氮量對果實品質指標的影響

果實品質由外觀品質和內在品質組成。由表3可以看出，隨施氮量的增加，FSI、L、a、FF、TSS、SSC和Vc含量均呈現先增加后減少趨勢，b和TA含量呈現先減少后增加趨勢。各施氮處理的L、a、b、TSS 含量、SSC 含量與對照 (N0) 之間均存在顯著差異；N50處理FSI、N400處理FF和N300處理TA，以及N300和N400處理Vc與N0無顯著差異，其它各施氮處理的FSI、FF、TA和Vc均與N0之間存在顯著差異。N200處理效果最為顯著，FSI、L、a、FF、TSS、SSC和Vc含量分別比N0處理增加了4.46%、41.07%、67.12%、20.16%、27.02%、26.71%和38.08%，b與TA含量分別比N0處理減少了30.63%和22.49%。

表3 施氮量對果實品質指標的影響Table 3 Effects of nitrogen application on fruit quality indicators

2.5 果實總鈣含量與品質指標的相關性

鈣含量與果實品質之間存在顯著相關。相關分析表明，FSI、L、a、FF、TSS、SSC和Vc均與果實中總鈣含量呈極顯著正相關 (P＜ 0.01)，相關系數分別為 0.6304、0.8021、0.9794、0.7811、0.9112、0.9522和0.7629，b、TA含量與果實中總鈣含量呈負相關，相關系數分別為–0.4660和–0.4150。表明果實內總鈣含量與果實品質形成密切相關。

2.6 不同形態鈣對果實品質的影響

不同形態鈣在果實內具有不同的功能，對果實品質指標的影響程度和方式不同。由表4可見，NaCl-Ca與H2O-Ca對果實各項品質指標的影響最大，表現為NaCl-Ca對FSI、b、FF、TA、SSC、Vc的影響位居首位，H2O-Ca對L、a和TSS的影響位居首位。不同果實品質指標受果實內不同形態鈣的影響順序不同，如：各形態鈣對FSI影響程度由大到小為 NaCl-Ca ＞ H2O-Ca ＞ HCl-Ca ＞ HAc-Ca，對FF 影響程度由大到小為 NaCl-Ca ＞ HCl-Ca ＞ HAc-Ca＞ H2O-Ca，對TSS影響程度由大到小為H2O-Ca ＞NaCl-Ca ＞ HCl-Ca ＞ HAc-Ca；NaCl-Ca 對 9 項品質指標均起促進作用，H2O-Ca對FSI、b、TA和果實Vc含量起抑制作用，對其余果實品質指標起促進作用，HAc-Ca對L、FF、TSS和Vc含量起促進作用，對其余品質指標起抑制作用，HCl-Ca對a、b和Vc含量起促進作用，對其余指標起抑制作用。

表4 不同形態鈣對各項果實品質指標的影響程度及方式Table 4 Influence degree and manner of different forms of calcium on each fruit quality index

3 討論

3.1 施氮量對果實不同形態鈣的影響

果實中的鈣以5種不同的形態存在，分別為水溶性鈣、果膠酸鈣、磷酸鈣，草酸鈣和殘渣鈣[11]。果實中各種形態的鈣都有其不同的生理功能，在一定的生理環境條件下相互轉化[12-14]。本試驗研究發現，施氮處理顯著提高了果實總鈣含量，施氮量在200 kg/hm2時，效果最為顯著，比對照增加了73.47%。此外，施氮量在200 kg/hm2時，果實中水溶性鈣、果膠酸鈣、磷酸鈣的含量均顯著增加。本試驗還發現，隨施氮量的增加，果實中不同形態鈣的比例發生了變化，水溶性鈣和果膠酸鈣含量變化最大。施氮量為200 kg/hm2時，水溶性鈣和果膠酸鈣占據總鈣含量的比例分別比N0增加了6.95%和3.15%。

分析富士蘋果果實中不同形態鈣的相關性，發現水溶性鈣與果膠酸鈣含量與總鈣含量呈極顯著正相關，說明氮處理增加總鈣含量，主要是增加了水溶性鈣和果膠酸鈣含量，這與王雷[28]、馬建軍等[11]、Silveira等[29]研究結果一致，說明水溶性鈣與果膠酸鈣的含量變化是影響果實中鈣積累的重要因子。水溶性鈣和果膠酸鈣為活性鈣，二者與草酸鈣呈正相關。說明隨總鈣含量的增加，二者占總鈣含量比例增高，活性鈣與草酸結合形成草酸鈣增多，從而避免液泡內鈣離子過多而影響液泡中陰陽離子平衡[30]。草酸鈣和大部分磷酸鈣沉淀在液泡內[14]，二者均由游離鈣離子結合而成，推測兩者存在競爭作用，因此呈負相關。并且根據果實內不同形態鈣的分布 (圖2)可以發現，在不同施氮量下，果實中不同形態鈣的變化趨勢不一致，且伴隨著一種形態鈣含量的增加，其余形態的鈣均不呈線性增加或降低，推測在不同施氮量下，富士蘋果果實內不同形態鈣之間發生了相互轉變。

3.2 施氮量對果實品質的影響

氮肥在蘋果果實品質的形成過程中有著極為重要的作用。適量施氮可改善果形和色澤[31]，但對于適宜施氮量研究結果[32-33]不同，可能與樹齡、品種以及地域差異有關。本試驗研究表明，施氮量在200 kg/hm2時，富士蘋果的果形指數、果皮亮度和紅綠色差顯著高于其他處理，說明200 kg/hm2的施氮量顯著改善了果實外觀，表現為果形指數變大，果皮亮度明顯提高，果實偏紅。施氮量過高或者過低，都不利于果實外觀品質形成。關于氮肥施用量對果實內在品質影響的研究已有很多，適量施氮可顯著提高可溶性固形物、維生素C及可溶性糖含量[32-34]，施氮量為300 kg/hm2時，庫爾勒香梨果實中的可滴定酸含量可降低0.1 g/kg[35]。本試驗結果顯示，施氮量在200 kg/hm2時，可溶性固形物、可溶性糖和維生素C含量分別比N0增加了27%、27%、38%，可滴定酸含量降低了22%，施氮量過高或者過低，果實內可溶性固形物、可溶性糖和維生素C含量均降低，可滴定酸含量升高，說明200 kg/hm2的施氮量有利于富士蘋果內在果實品質的形成。

果實品質指標間存在顯著相關性。可溶性糖、可溶性固形物含量與可滴定酸呈顯著負相關，可能是因為果實發育過程中，一部分酸轉化為糖，另一部分作為呼吸底物被消耗了[36]。糖分積累是著色的基礎[37]。研究表明，果實著色度與可溶性固形物、可溶性糖含量呈顯著正相關，與果實硬度呈顯著負相關，因此李猛等[38]將果實著色度作為分級貯藏的重要依據。在維生素C主要合成途徑L-半乳糖合成途徑中，可溶性糖是主要底物，較高的可溶性糖可促進維生素C合成，可能是糖和維生素呈正相關的原因[39]。果實各項品質指標間存在高度相關性。雖然這些相關性存在差異，但正是這些不同指標之間的相互制約關系，形成了富士蘋果獨特的品質和特色[40]。

3.3 不同形態鈣與果實品質指標的關系

鈣對果實品質的形成起重要作用。研究表明，果實內適宜的鈣含量有利于果實硬度的增加，可溶性固形物和可溶性糖含量提高[41]，這與本研究結果一致。果實內鈣含量與果形指數、果實硬度、可溶性固形物含量、可溶性糖含量等果實品質指標之間表現出高度相關性，且相關系數達到極顯著水平 (P＜0.01)，說明果實內鈣含量可顯著影響果形指數、果實硬度、可溶性固形物含量等果實品質指標。不同形態鈣在果實中有著不同的功能[12]，水溶性鈣和果膠酸鈣是果實中的活性鈣，能維持細胞壁的穩定，提高果實硬度[42]；磷酸鈣的形成與ATP的能量代謝相聯系，當果實中磷酸鈣過多時，磷酸基的能量代謝受阻[43]；草酸鈣的形成可阻止果實中由于草酸過多破壞中膠層而誘發的苦痘病[44]。但不同形態鈣對果實各項品質指標的影響程度及影響方式不明確，在此基礎上，本研究評估單一形態鈣以及多種類型鈣對果實品質各項指標的影響發現，對于某一項果實品質指標而言，對其影響較大的鈣形態多為1種或1種以上，并且4種形態鈣的影響程度和影響方式不同[26]。其中果膠酸鈣與水溶性鈣為影響果實品質指標的兩種主要形態[25]，對各項果實品質指標的影響最大。本研究還發現，果膠酸鈣對各項果實品質指標均起促進作用，說明果實中果膠酸鈣含量增加有利于提高果實品質。水溶性鈣、磷酸鈣和草酸鈣對果實某些品質指標有促進作用，對某些品質指標有抑制作用，且其中一種形態鈣對某項品質指標不能同時起促進或者抑制作用[26]。因此，為獲得高品質的果實，需要對不同施氮量下果實內不同形態鈣與果實品質指標的關系進行更加深入地研究，以達到通過調節施氮量，調控不同形態鈣的含量和組成比例，進而提升果實品質的最終目的。

4 結論

1) SH38中間砧富士適宜施氮(N)量 為200 kg/hm2，此時果實品質最好，果實果形指數較大，果皮亮度和紅綠色差最高，可溶性固形物、可溶性糖、維生素C含量最高，可滴定酸含量最低。

2) 施氮可增加果實中總鈣含量，改變各形態鈣的組成比例。施氮(N)量為200 kg/hm2時，果實中總鈣含量最高，對品質影響最大的鈣形態為果膠酸鈣和水溶性鈣，果膠酸鈣對各項品質指標均起促進作用。