基于液相色譜-飛行時間質譜的白花龍葉化學成分分析

歐陽勝祥　姚文華　唐熙麟　李青　朱慶妮　黃?！￡悘┍蟆〗鹜↓堬w

摘 要 通過液相色譜-飛行時間質譜聯用技術定性分析白花龍葉甲醇提取物中的化學成分，為白花龍葉的進一步研究和開發提供依據。色譜分離采用C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），以0.2%甲酸-乙腈為流動相梯度洗脫，流速0.3 mL·min-1，質譜定性采用飛行時間質譜，正負離子模式掃描。結果：從白花龍葉中鑒定出54種化合物，其中黃酮類9種，有機酸類9種，酯類4種，糖類5種，氨基酸7種，香豆素類6種，木脂素類6種，酚類3種，醛類、苯丙酸類、萜類、苷類和維生素類各1種。針對白花龍葉，本研究建立了一種基于LC-ESI-TOF-MS/MS技術分析鑒定其化學成分的方法，發現含有許多對人體有保健功能的成分。

關鍵詞 白花龍葉;液相色譜-飛行時間質譜;化學成分

中圖分類號：Q501文獻標志碼：ADOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.01.001

白花龍（Styrax faberi Perk.）為安息香科安息香屬植物，主要分布于我國長江流域以南各省區，生長在海拔100～600 m的低山區和丘陵灌叢中[1]。

湖南郴州、岳陽等地人們常用白花龍葉當茶飲，飲用歷史達百年之久。已有的研究表明，安息香屬植物的花、葉、果均可入藥，具有清熱解毒、開竅行氣、活血止痛的作用，可治療風濕關節炎、胃痛等[2]，并對預防皮膚衰老和治療皮膚癌等有重要作用[3]，其葉對鎘的去除也有明顯效果[4]。目前白花龍多為野生，對于白花龍葉中所含有的具體化學成分尚未見系統的文獻報道[5]，也一直未被深度開發利用。對白花龍葉片中的化學成分進行研究，有利于充分開發這一植物資源在飲用和藥用方面的價值。本研究采用液相色譜-三重四級桿/飛行時間高分辨質譜聯用技術對白花龍葉片的化學成分進行定性分析，旨在為白花龍葉的進一步研究和開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生白花龍樹葉，經殺青、曬干制得。

1.2 儀器與試劑

AB 5600+三重四級桿飛行時間質譜儀（美國AB Sciex公司）;島津LC-30A液相色譜儀;高速低溫離心機（Sigma公司）;NC1500-T非接觸式超聲波處理器（上海歐河機械設備有限公司）。甲酸、乙腈為HPLC級，其他試劑為分析純，具體制備方法參照王軍[6]、李嘉蓉[7]等人的文獻。

1.3 色譜條件

色譜柱為C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）;柱溫為35 ℃;流速為0.3 mL·min-1;進樣量為5 μL;流動相采用乙腈-0.2%甲酸水溶液的梯度洗脫程序（見表1）。

1.4 質譜條件

離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓 5 500 V，離子源溫度600 ℃，去簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）35 eV，碰撞能量擴展（CES）為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為50～1 000，在IDA設置響應值超過100 cps的6個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態背景扣除（DBS）。

離子化模式為電噴霧負離子模式，離子源電壓 -4 500 V，離子源溫度500 ℃，去簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）-35 eV，碰撞能量擴展（CES）為15 eV。霧化氣體為氮氣，輔助氣1為60 PSI，輔助氣2為50 PSI，氣簾氣為40 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為50～1 000，在IDA設置響應值超過100 cps的6個最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為50～1 000，開啟動態背景扣除（DBS）。

1.5 供試品制備方法

取白花龍干燥葉片粉碎得粉末，取粉末0.5 g于10 mL玻璃試管內，加入5 mL 50%甲醇-水溶液浸泡4 h，然后40 ℃超聲40 min;取此中藥提取液2 mL于2 mL離心管內，以2 000 r·min-1低溫（4 ℃）離心10 min，過0.22 μm微孔濾膜后裝入1.5 mL自動進樣瓶，得到中藥提取物樣品。同樣條件得到空白對照樣品。將樣品放入4 ℃冰箱保存，在分析前取出（保存時間不能超過24 h）。

1.6 數據分析方法

通過文獻調研，查找了文獻報道的安息香科植物常見化學成分及植物常見萜類、酚酸類、黃酮類、蒽醌類、脂肪酸類、生物堿類、木脂素、香豆素類、苷

類、維生素及氨基酸等化學成分，采用液相色譜-三重四級桿-飛行時間高分辨質譜聯用技術，將所獲得的化合物精確分子質量、碎片離子峰、色譜保留時間與數據庫中的化學成分進行匹配，并結合METLIN數據庫和HMDB數據庫，定性分析白花龍葉的化學成分。

2 結果與分析

擬定分析條件下，白花龍葉甲醇超聲提取液中化學成分正負離子模式下總離子流圖見圖1。

對總離子流圖中的一級質譜信號較強的譜峰進行二級質譜分析得到特征碎片，進一步獲得化合物的化學結構式。通過質譜提供的準確分子質量推導出化合物的分子式，再依據特征碎片二級質譜圖信息，與相關文獻數據比對，并結合METLIN數據庫和HMDB數據庫，共推測出54種成分，結構類型可分為 13類（見表2）。

2.1 黃酮類化合物

從白花龍葉中鑒定出9種化合物：忍冬苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、蘆丁、柚皮素、鼠李素、白前苷B、黃腐酚。其保留時間分別為6.238、8.447、8.243、8.182、3.527、12.552、7.589、9.392、14.473 min，相對分子量分別為594.5、302.2、286.2、270.2、610.5、272.3、316.3、448.4、354.4。忍冬苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、蘆丁、柚皮素、鼠李素、白前苷B、黃腐酚在二級質譜圖中對應出現的碎片峰分別為m/z255、285、284，m/z303、257，m/z153、213、287，m/z115、141、197，m/z283、285、255，m/z119、117，m/z217、245、302，m/z447、448、449，m/z137、151、203、307。根據結果分析，參考文獻[8]得出皆為黃酮類化合物。

2.2 氨基酸類化合物

氨基酸是組成蛋白質的基本單位，同時也是重要的活性物質，在反相色譜中保留弱。本研究通過待測物的精確分子質量、分子式和一級二級質譜圖等信息，結合文獻[8-9]的研究，共鑒定出苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、脯氨酸這7種氨基酸。

2.3 酚類物質

酚類物質一般極性較大，在反相色譜中保留較弱，由于存在苯環等大共軛體系，一般具有較強的紫外吸收。

本實驗經HPLC二級管陣列檢測器的全波長掃描，結合文獻[8-10]的報道，對質譜鑒定結果進行確認。共鑒定出沒食子兒茶素、去甲氧基姜黃素和去氫二異丁香酚3種酚類物質。

2.4 香豆素類物質

香豆素類化合物具有抗HIV、抗癌、降壓、抗心律失常、抗骨質疏松、鎮痛、平喘及抗菌等多方面生物學活性，本實驗以圖譜數據為基礎，參照文獻[11-13]，共鑒定出6種香豆素類物質：二氫歐山芹醇當歸酸酯、8-甲氧基異歐前胡內酯、東莨菪苷、歐前胡素、紫花前胡素、羥甲香豆素。

2.5 有機酸類物質

根據文獻[8，10，14]，結合本實驗的波譜數據，共鑒定出9種有機酸物質：5-（9H-fluoren-9-yl-methoxy）-5-oxop-entanoic acid、肉桂酸、苯甲酸、香草酸、亞麻酸、亞油酸、膽酸、軟脂酸、D-葡萄糖醛酸。

2.6 木脂素類物質

木脂素類物質是安息香屬植物中文獻報道最多的一類化合物，從根、莖、種子中都曾分離得到過，但未見到從葉中分離得出的報道。在本實驗基礎上，結合[9，15-16]等文獻，鑒定出6種木脂素類物質：桉葉素、襄五脂素、木蘭脂素、異紫杉脂素、松脂素、落葉松樹脂醇。

2.7 其他類型化合物

利用LC-ESI-TOF-MS/MS所顯示的紫外吸收光譜、保留時間、分子式和質譜碎片信息，結合文獻[9，15，17]，鑒定了4種酯類物質：肉桂酸苯丙酯、水楊酸甲酯、桂酸桂酯、苯甲酸乙酯;結合文獻[18]，鑒定了5種糖類：蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、龍膽二糖、水蘇糖四水合物;參照文獻[8-9]，鑒定了安息香屬植物報道較多的醛類物質香草醛;依照文獻[15]，鑒定出曾在安息香樹枝和根莖中鑒定到的萜類物齊墩果酸;參照文獻[19-20]，鑒定出苯丙酸類阿魏酸;結合文獻[25]，獲得苷類物質苔黑酚龍膽二糖苷;參考文獻[21-23]，鑒定出維生素PP（煙酸）。

3 討論

高效液相色譜-飛行時間質譜技術具有樣品處理簡單、用量少，快速高效、靈敏度高等特點，依據高分辨率和精準分子質量及一、二級質譜峰提供的碎片信息，使定性分析的準確度得到大幅提高，是植物化學成分分析的重要手段。但該技術還存在一定的局限性，比如在同分異構體的辨別和質譜碎片的裂解途徑等方面不能獲得精準的結果，還需要結合其他技術手段或資料，才能得到最終的確認。

白花龍葉泡茶飲用，具有似薄荷般清涼的口感，并能快速祛痰、平喘，在民間已有上百年的飲用歷史。但對白花龍的研究非常少，近年來才有人對其栽培繁育[24-26]、園林綠化[27]方面進行研究探索，而對于白花龍葉中所含有的具體化學成分還未見系統的研究報道。本研究對白花龍葉中的化學成分進行定性分析，證實了其中含有許多對人體有保健作用的成分，從而也解釋了湖南民間有人長期用其泡茶的緣由。針對這些特殊化學成分的含量和保健功效，有待于做進一步的定量研究和活性分析。

參考文獻：

[1] 中國科學院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京：科學出版社，1975.

[2] 謝宗萬.全國中草藥匯編[M].北京：人民衛生出版社，1996.

[3] Hyungin Moon，Iae-Chul Jung.Faythrediol-3-acetate Isolated from Styrax faberi.the Inhihiticen of UV-induced，Celatinases Bin Cultured Human Keratinocyte Cells[Z].Phytomedicine，In Press，Corrected Prod.Available Online，2007-02-27.

[4] Salim R，Al-Subu M，Dawod E.Efficiency of Reroval of Cadmium froon Aqucous Solutions by Plant Leaves and the Effecte of Internaction of Combinabons of Leaves on Their Ramoval Eficiency [J].Joumal of Enviromental Management，2008，3：521-532.

[5] 陳勝璜，楊德俊，黃志超.安息香樹葉中總香脂酸的含量測定[J].中國醫藥導報，2007（12）：108.

[6] 王軍.天然藥物化學實驗教程[M].廣州：中山大學出版社，2007.

[7] 李嘉蓉.天然藥物化學實驗[M].北京：中國醫藥科技出版社，1998.

[8] 叢浦珠.質譜在天然有機化學中的應用[M].北京：科學出版社，1987.

[9] 李碧君，劉瑤，王峰.安息香的化學成分研究[J].中國藥房，2016，27（15）：2095-2097.

[10]張亞梅，張普照.白辛樹皮化學成分[J].中國實驗方劑學雜志，2015（23）：58-60.

[11]王峰，方振峰.安息香化學成分研究[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）：89-92.

[12]張韶瑜，孟林，高文遠.香豆素類化合物生物學活性研究進展[J].中國中藥雜志，2005（06）：410-414.

[13]鄭永唐.文冠果種皮中的香豆素類化合物及抗HIV-1活性研究[J].北京林業大學學報，2007（05）：73-83.

[14]陳林，康文藝.長頸芒毛苣苔化學成分研究[J].中國藥學雜志，2009，34（21）：2758-2760.

[15]王峰，鄢瓊芳，華會明.安息香屬植物化學成分及藥理作用研究進展[J].廣東藥學院學報，2009，25（05）：541-545.

[16]張亞梅，張普照.瓦山安息香樹皮的化學成分研究（Ⅱ）[J].安徽農業科學，2015，46（35）：217-219.

[17]李國鵬.中國梨果實揮發性物質鑒定及酯類物質生物合成相關基因表達的研究[D].杭州：浙江大學，2012.

[18]管偉杰.淺談利用高性能液相色譜法進行食品糖類鑒定[J].化工管理，2018（01）：40，51.

[19]宋浩亮，羅華菲，官洪義.阿魏酸及其制劑的穩定性研究[J].安徽醫藥，2003（04）：252-253.

[20]王曉明，張帆，劉瑩.LC-MS/MS法測定升麻中咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸含量的研究[J].天津中醫藥，2014，31（11）：686-689.

[21]汪瀅，劉雷.仙茅中酚苷類成分高效液相色譜法測定方法的建立[J].中國藥學雜志，2012，47（05）：375-379.

[22]趙姝.花生中煙酸的提取及功能特性的研究[D].吉林：吉林農業大學，2017.

[23]王大明.煙酸的生物轉化與提取工藝研究[D].石家莊：河北師范大學，2012.

[24]吳永清，黃嘉琦，胡秀，等.白花龍扦插繁殖研究[J].仲愷農業工程學院學報，2018，31（04）：30-34.

[25]程家壽，周林濤，潘健，等.外源激素對白花龍插條生根的影響[J].資源開發與市場，2011，27（06）：496-497.

[26]歐陽勝祥，姚文華，唐熙麟，等.白花龍引種適應性研究[J].作物研究，2018（S1）：109-112.

[27]童麗麗.一種把白花龍由灌木培養成小喬木的方法.中國，CN109526514A[P]，2019-03-29.

（責任編輯：丁志祥）

收稿日期：2020-09-10

作者簡介：歐陽勝祥（1981—），男，湖南常德人，碩士，農藝師，主要從事林木培育和經濟林研究。E-mail：258456237@qq.com。