大黃酸對小鼠非酒精性脂肪肝病的治療效果分析

林曉平， 余立華

海軍軍醫大學基礎醫學院基礎醫學實驗教學中心， 上海 200433

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史、肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。隨著肥胖癥的發病率逐年升高，NAFLD的發病率也不斷攀升。流行病學的數據[1]表明，約25%的美國人罹患NAFLD，其中30%進展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，而約20%NASH患者最終會發展為肝硬化。近年來，我國的NAFLD患病率逐年增長。一項meta分析[2]的結果表明，2000年至2006年我國大陸地區所報道的NAFLD患病率為18.22%(95%CI 14.32%～22.48%)，而2007至2009年所報道的NAFLD患病率為20.00% (95%CI 16.84～23.36)，2010至2013年患病率上升至20.68% (95%CI 17.28%～24.30%)。盡管目前仍缺少大陸地區NAFLD進展為NASH甚至是肝硬化的確切百分比，但可以預見的是，未來30～50年內由NAFLD導致的終末期肝病所帶來的醫療負擔不容忽視。

目前針對NAFLD的治療，可選擇的藥物較少，如胰島素增敏劑、抗氧化劑、降脂藥和護肝藥等[3-4]，且多屬于對癥支持藥物，缺乏特異性藥物。近年來，研究者[5-8]利用全基因組關聯分析的方法(genome-wide association study, GWAS)確定肥胖相關基因(fat mass and obesity associated gene，FTO)是導致人類肥胖的候選基因。多項研究[5-6]結果表明，FTO基因的多態性位點與成人、兒童的體質量指數、體質量增長、脂肪含量增加等相關。而在NAFLD患者的肝組織中FTO的表達量顯著增高[7]。然而FTO在肥胖癥及NAFLD發生、發展過程的作用機制并不確切。最近，有研究者[8]發現，FTO是RNA 的m6A去甲基化酶，植物提取物大黃酸(rhein)在體外可競爭性地與FTO去甲基化酶活性位點結合，且對細胞內的m6A去甲基化過程也有較好的抑制作用。

因此，本研究擬觀察rhein對高脂飲食導致的小鼠NAFLD的治療效果，旨在為NAFLD治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 Rhein購自上海源葉生物，其純度為HPLC≥98%。高脂小鼠飼料購自戴茨生物科技(無錫)有限公司。FTO抗體購自英國Abcam 公司。二抗為Rdye800標記的羊抗兔IgG 和 IRdye700 標記的羊抗鼠IgG (Li-Cor公司)。油紅染色試劑購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 NAFLD小鼠模型及治療 無特定病原體(SPF)級雄性C57BL/6小鼠30只，由海軍軍醫大學實驗動物中心提供。隨機分為3組：普飼組，高脂組，高脂+rhein組。根據以往的文獻報道[9-10]，rhein用PBS配置成5 g/L混懸液，隔天固定時間120 mg·kg-1·d-1灌胃，非rhein組均予等量PBS灌胃。

1.3 觀察指標及檢測方法 每周進行小鼠稱重并記錄，并于實驗開始后的第2周測量計算每組小鼠在3 d內的攝食量，并連續測量21 d。第7周結束后，從眼眶靜脈取血，按常規制備血清標本。常規方法處死小鼠后迅速取出肝臟，從肝右葉中部取肝組織2塊，其中一塊按常規制備肝組織冰凍切片標本，另一塊用液氮進行速凍后存入-80℃冰箱中用于Western印跡檢測。(1)生化分析：采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。(2)油紅染色：取出預先制備好并保存在-20℃冰箱中的冰凍切片，放置在室溫回溫5～10 min；按照貯備液∶稀釋液=5∶2的比例配制染色液，并用濾紙慢速過濾備用；冰凍切片置入染色液中15 min，此后37℃蒸餾水中漂洗15 s；并復染5 min，水洗45 s；封片后即進行鏡檢。(3)組織蛋白表達水平檢測：采用Western印跡方法檢測組織中蛋白的表達水平。組織分組同上，使用RIPA裂解液裂解組織得到總蛋白，使用BCA法定量蛋白濃度，使用SDS-PAGE進行蛋白電泳，并電轉至硝酸纖維素膜，使用脫脂奶粉溶液封閉過夜，次日加入相應二抗孵育(帶熒光)后使用Odyssey (Li-Cor公司)進行掃描，定量檢測FTO蛋白表達水平。選用β-actin作為定量的內參。

2 結 果

2.1 小鼠體質量及攝食量的改變 自實驗開始的第2周，連續21 d測定每組小鼠(10只)在3 d內的攝食量。結果(圖1A)顯示，與普飼組比較，高脂組小鼠的攝食量明顯降低(P<0.01)， rhein灌胃后，小鼠攝食量并沒有明顯恢復。每周在相同時間點稱重小鼠體質量。與高脂組比較，高脂+rhein組小鼠體質量增加明顯減緩(圖1B)。在第7周，高脂+rhein組小鼠的體質量明顯低于高脂組(P<0.05)。

圖1 實驗過程中各組小鼠攝食量及體質量的改變A：圖中的每一點代表10只小鼠在3 d內的攝食量。自第2周開始，每3 d進行一次測量，連續測量了21 d；B：每周在固定時間點測量小鼠體質量. Control： 普飼組； HFD： 高脂組； HFD+rhein： 高脂+rhein組. **P<0.01，*P<0.05

2.2 小鼠肝臟脂肪沉積的改變 在實驗7周結束后，取各組小鼠的肝組織進行H-E染色以確定肝臟組織中脂肪沉積情況。結果(圖2)顯示：在高脂組小鼠肝細胞中脂肪空泡明顯多于普飼組，表明非酒精性脂肪肝病造模成功。而與高脂組比較，高脂+rhein組小鼠肝細胞中脂肪空泡明顯減少，表明rhein有減少肝細胞脂肪沉積的作用。為了進一步驗證上述結果，采用油紅對肝細胞中的沉積脂肪進行染色。高脂組小鼠肝細胞中脂肪沉積明顯多于普飼組，rhein灌胃的小鼠肝細胞中脂肪沉積明顯減少。

圖2 各組小鼠肝臟組織中脂肪沉積情況A：3組H-E染色和油紅染色結果. B：使用 Image J軟件對油紅染色照片中染色信號進行定量分析(n=3). Control：普飼組；HFD：高脂組；HFD+rhien：高脂+rhien組

2.3 小鼠肝功能的改變 為進一步驗證rhein是否可以影響肝臟脂質代謝及肝功能，在實驗7周結束后，留取各組小鼠的血清，并測量ALT、AST、LDL和HDL。實驗結果(圖3)顯示，在高脂組小鼠中肝功能明顯受損，而采用rhein灌胃后，小鼠的肝功能有明顯恢復(圖3A、3B)。LDL和HDL測量的結果(圖3C、3D)顯示，與普飼組的小鼠比較，高脂組小鼠脂肪代謝明顯紊亂。

圖3 各組小鼠血清中ALT、AST、LDL和HDL濃度改變Control： 普飼組; HFD: 高脂組; HFD+rhein: 高脂+rhein組. **P<0.01，*P<0.05

2.4 小鼠肝臟組織中FTO表達量的改變 結果(圖4)顯示，FTO蛋白在高脂組小鼠的肝組織中顯著增多，而在高脂+rhein組小鼠肝組織中FTO蛋白的表達量明顯回落。

圖4 Western blot檢測各組小鼠肝組織中FTO蛋白表達量 Control: 普飼組; HFD: 高脂組; HFD+rhein: 高脂+rhein組

3 討 論

隨著社會經濟發展及生活方式變遷，肥胖癥、高血壓、糖尿病、NAFLD等慢性疾病對人類健康的危害越來越引起重視。NAFLD如得不到有效控制，相當大比例的患者會進展為NASH，甚至是肝硬化。已有研究[9-10]表明，NAFLD具有一定的遺傳易感性，多個GWAS研究結果[11-12]顯示，SNP位點可增加NAFLD的患病風險。更重要的是，飲食結構改變、運動量減少等環境因素是導致NAFLD發病的主要危險因素。

然而，目前針對NAFLD治療的方案多半不具有特異性，以對癥支持治療為主，如降脂、抗炎、抗氧化等。一方面，治療的效果有待商榷；另一方面，這些治療措施可能會帶來其他不良反應。之所以缺少特效藥，是因為目前人們對NAFLD的進展機制及干預的靶點并不清楚。20余年前人們就已經發現FTO基因的多態性與肥胖癥相關。近年來，研究者[8]發現FTO可作為RNA m6A 去甲基化酶而發揮著重要作用。特別是多項研究[13-14]表明，FTO的高表達會促進血液系統腫瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發生與進展。眾所周知，NAFLD可能會進展為NASH，從而啟動肝臟的慢性炎癥過程，激活肝臟組織中的星狀細胞，促進纖維化過程，最終導致肝硬化、原發性肝細胞癌。已有文獻[7]稱，FTO在NAFLD患者的肝組織明顯上調表達，表明FTO可能是阻斷該病進展的干預靶點。

Rhein中文名大黃酸，是植物提取物。一直以來作為減肥藥、抗炎藥、抗腫瘤藥而被廣泛探討。也有研究[15-16]表明，rhein可改善高脂飲食所導致的大鼠NAFLD。本研究結果也表明，rhein可以減少NAFLD過程中肝細胞中脂肪沉積，促進肝功能恢復，具有明確的NAFLD治療效果。然而，rhein作用的靶點并不明確。近期研究[8]表明，rhein在體外可競爭性地與FTO去甲基化酶活性位點結合，并且抑制其去甲基化酶的作用，這一發現為rhein作用靶點的確定提供了機會。本研究發現NAFLD會導致肝組織中FTO蛋白表達上調，而在rhein的作用下FTO蛋白表達水平明顯下調，這些結果表明，rhein可能通過減少FTO蛋白的表達而改善NAFLD患者肝臟組中脂肪沉積以及肝功能損害。可見，rhein可作為NAFLD治療的藥物。

本研究也存在一定的局限性：首先，本研究僅僅是動物實驗，對rhein的有效劑量范圍，可能存在的不良反應，在人類NAFLD治療中是否有效等問題，目前仍然沒有解決，還需要更進一步的系統研究。第二，本研究發現rhein可減少NAFLD小鼠肝組織中FTO蛋白表達量，但其機制并不清楚。更重要的是，除了FTO可能是rhein作用的靶點，rhein在NAFLD治療中其他的作用靶點也不明確。