胃癌患者HLA-I表達水平與免疫活性細胞反應及預后的相關性

張 玲，宿冬遠，姜 政

胃癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，根據WHO統計結果顯示，亞洲范圍內胃癌的發病率居全球惡性腫瘤發生率的第7位，病死率在10%左右[1-2]。在我國胃癌的發病率僅次于第1位的肺癌，由于早期胃癌無明顯癥狀，多數患者初診時已為晚期，而晚期胃癌患者多伴隨淋巴或血液轉移，往往預后較差[3]，因此針對胃癌侵襲能力及預后生物標志物的篩選研究成為熱點方向之一。機體的免疫系統通過識別并殺傷腫瘤細胞來阻止腫瘤發生進展的這一過程被稱為免疫監視[4]，雖然大多數的腫瘤抗原具有免疫原性，但機體的免疫系統并不能完全有效的祛除腫瘤細胞，與腫瘤細胞的免疫逃逸有關[5]。

人類白細胞抗原(human leukocyte angigen，HLA)是參與內源性抗原肽加工、處理及提呈的重要抗原[6]。目前研究證實HLA-I表達的降低或缺失會使得HLA-I向T細胞呈遞的抗原多肽無法被細胞毒性T細胞識別，導致腫瘤細胞逃避免疫監視繼續發展[7]。但胃癌中HLA-I與免疫活性細胞反應及預后之間的相關研究鮮少報道，因此本研究通過免疫組化檢測胃癌組織中HLA-I及微環境中免疫活性細胞浸潤情況，來分析HLI-I與免疫活性細胞反應及預后之間的關系，探討HLA-I在胃癌發生中的作用。

1 資料和方法

1.1臨床資料 收集本院2014年12月—2016年12月期間胃腸外科、消化科及腫瘤科胃癌患者手術切除的胃癌組織石蠟標本80例為癌組織組，并取同期非胃癌胃破裂穿孔患者的正常胃組織石蠟標本80例為正常胃組織組。胃癌組織組患者均經資深病理科醫師閱片后確診；男56例，女24例；年齡43～75(57.3±7.2)歲；淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移49例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期35例，Ⅲ/Ⅳ期45例。正常胃組織組男52例，女28例；年齡40～73(55.6±6.8)歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1主要試劑：HLA-I鼠抗人單克隆抗體(1∶100)購自日本MBL公司；兔抗人CD11c單克隆抗體(1∶200)購自英國abcam公司，用于標記樹突狀細胞；即用型鼠抗人CD45 RO、CD8單克隆抗體購自邁新生物技術開發公司，分別用于標記記憶性T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞；羊抗鼠和兔二抗，DAB顯色液均購自邁新生物技術開發公司。

1.2.2免疫組化：將固定好的胃癌組織及正常胃組織制成切片。將制好的切片放入60℃烤箱內烘烤2 h完成脫水、脫蠟及抗原修復之后，用50 ml的3%過氧化氫洗滌，放入37℃烤箱中烘干25 min，PBS漂洗3次，每次5 min，分別加入一抗4℃過夜，次日室溫復溫20 min后用PBS漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗37℃條件下孵育30 min，加入適量二氨基聯苯胺(DAB)顯色后，繼續加入蘇木素復染10 min，流水下洗凈，二甲苯脫水透明后加入中性樹膠封片，鏡檢。以試劑盒提供的已知陽性表達切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.3結果判定標準：所有閱片均由兩位高年資病理醫師進行雙盲法評估結果。具體方法為每張切片400倍鏡下隨機選取5個視野，并在視野上計數100個細胞，首先觀察細胞染色強度，無變色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；接著計算陽性細胞百分比，<10%為0分，10%～20%為1分，21%～50%為2分，>50%為3分。取2項評分的乘積記為每個標本的染色積分，積分<3分判定為陰性，≥3分判定為陽性。

1.3隨訪 患者自手術切除后開始門診復查或電話隨訪，治療后1年內每3個月門診復查1次，2年內半年復查1次，以后至少每年復查一次。隨訪記錄生存時間及隨訪時狀態(存活、死亡或其他)。

2 結果

2.1胃癌組織及正常胃組織中HLA-I及免疫活性細胞表達情況 胃癌組織組HLA-I、CD11c+樹突狀細胞、CD45RO+記憶性T細胞、CD8+細胞毒性T淋巴細胞陽性表達率均低于正常胃組織組(P<0.01)。見表1。

表1 胃癌組織及正常胃組織中HLA-I及免疫活性細胞陽性表達情況[例(%)]

2.2HLA-I表達水平與臨床病理特征及免疫活性細胞反應的相關性 胃癌組織中HLA-I的表達與淋巴結轉移、分化程度、TNM分期、CD11c+樹突狀細胞、CD45RO+記憶性T細胞、CD8+細胞毒性T淋巴細胞表達有關(P<0.05)。見表2。

表2 HLA-I表達水平與臨床病理特征及免疫活性細胞反應的相關性[例(%)]

2.3單因素分析 80例胃癌患者術后隨訪時間為3.8～61.5個月，中位隨訪時間為28.7個月，3年內無病生存率為53.75%(43/80)。單因素分析顯示淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、腫瘤直徑≥4 cm、3種免疫活性細胞陰性表達、HLA-I陰性表達均是胃癌患者預后生存的影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 胃癌患者預后生存的單因素分析

2.4胃癌患者預后生存的多因素Cox回歸分析 多因素Cox生存分析模型分析顯示，淋巴結轉移、Ⅲ/Ⅳ期、3種免疫活性細胞陰性表達、HAL-I陰性表達是胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

表4 胃癌患者預后生存的多因素Cox回歸分析

3 討論

機體抗腫瘤機制主要由細胞免疫介導，其中細胞毒性T淋巴細胞作為特異性消除癌細胞的主要效應細胞，需識別腫瘤細胞表面具有免疫活性的不同類型HLA-I類分子才能殺傷腫瘤細胞[8]。HLA-I類分子表達降低或者缺失均會導致細胞毒性T淋巴細胞識別功能異常，從而使腫瘤細胞免疫逃逸[9]。本研究結果顯示，胃癌組織組HLA-I的陽性表達水平顯著降低，且胃癌微環境中樹突狀細胞、記憶性T細胞、細胞毒性T淋巴細胞等免疫活性細胞的陽性表達水平也顯著降低，這提示機體的免疫功能對腫瘤細胞反應無能，這一過程可能與HLA-I介導的免疫逃逸關系密切。Park等[10]研究發現，HLA-I類分子作為所有有核細胞上的可被CD8+細胞毒性T細胞識別的肽抗原，在Ⅱ、Ⅲ期胃癌患者中的陽性表達率僅為34.7%和40.5%，并且HLA-I陰性表達與CD8+細胞毒性T細胞浸潤呈負相關。本研究發現，HLA-I表達水平與樹突狀細胞、記憶性T細胞、細胞毒性T淋巴細胞等免疫活性細胞表達相關。樹突狀細胞作為機體內功能最強的抗原提呈細胞，對維持T細胞的記憶功能是必需的[11]，而胃癌組織中低表達情況可能是因為HLA-I類分子的表達受到多種參與抗原加工提呈過程的相關蛋白影響，使得腫瘤細胞內被降解的多肽無法有效的提呈給HLA-I類分子，影響到細胞膜上表達的密度及穩定性，從而無法被CD8+細胞毒性T細胞識別[12]，另外非經典的HLA-I類基因也會抑制NK和T細胞的功能進而促進腫瘤細胞的免疫逃避機制[13]。

本研究結果顯示，HLA-I在有淋巴結轉移、低分化水平、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期患者癌組織中表達水平顯著降低，提示HLA-I可能在胃癌的發生早期及整個進展過程中均發揮著重要的作用，并且能夠在一定程度反映出胃癌的惡性程度，而惡性程度越高可能患者的預后也越差。通過Kaplan-Meier分析發現，淋巴結轉移、TNM分期、腫瘤直徑≥4 cm、3種免疫活性細胞陰性表達、HAL-I陰性表達是胃癌患者預后的影響因素。有研究認為，腫瘤局部浸潤的記憶性T細胞與樹突狀細胞越多，患者的無瘤生存率也越高[14-15]，可能是當腫瘤微環境中免疫活性細胞反應較強，異常表達的相關蛋白能夠被快速的識別并破壞，同時也能夠破壞侵入至淋巴結中的腫瘤細胞，阻止癌細胞的發展，同時較高水平的HLA-I表達提示腫瘤細胞表面的HLA-I類復合物結構穩定，呈遞的抗原肽更容易被細胞毒性T淋巴細胞識別而殺傷癌細胞，阻止癌細胞的發展[16]。多因素Cox生存分析模型分析也進一步證實了淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、3種免疫活性細胞陰性表達、HAL-I陰性表達是胃癌患者預后的獨立危險因素。

綜上所述，HAL-I類分子作為腫瘤抗原肽呈遞的關鍵分子，其表達降低會引起胃癌局部微環境中樹突狀細胞、記憶性T細胞、細胞毒性T淋巴細胞等免疫活性細胞浸潤減少，致使腫瘤細胞逃避免疫監視，躲避殺傷，從而向淋巴結或其他部位轉移，導致患者預后較差，因此通過提高腫瘤細胞表面HLA-I表達情況，增強腫瘤抗原特異性免疫應答可能是靶向治療的方向之一。但本研究樣本量較小，還需要擴大病例數做進一步研究。