鷺鷥草組織培養再生體系的建立

朱恒星，戴前莉，盧 敏，黃飛逸，雷光祥，陳本文

（1.重慶市林業科學研究院，重慶市 400036；2.重慶市巴南區退耕還林管理中心，重慶市 401320）

鷺鷥草（Diuranthera major）又名鷺鷥蘭，為我國特有的百合科（Liliaceae）鷺鷥草屬多年生草本植物，有較高的觀賞和藥用價值。迄今，該屬僅發現3個物種：鷺鷥草、小鷺鷥草（D.minor）和南川鷺鷥草（D. inarticulata）[1]，根內均含鷺鷥蘭甙A、B、C、D和E 等藥用化學成分[2-4]；其中，鷺鷥草在我國方劑產品中廣泛應用。由于生境遭到破壞，鷺鷥草僅零星分布于我國四川、云南和貴州等野外地區[5]，目前以野生采挖為主要來源，急需開展該瀕危物種的保護，對于發展鷺鷥草民族醫藥產業意義重大。

近年來，百合科植物的組織培養技術已相對成熟，可實現工廠化育苗，多以鱗莖[6]和種子[7]等為外植體實現無性快繁[8-9]。鷺鷥草肉質根污染率高，種子后代分化較大，不宜進行優系繁育。 目前，已有花序軸成功建立組培再生體系的報道[10-11]，鷺鷥草花量較大，便于取材繁殖，其相關研究未見報道，僅有少量與種子萌發有關的研究[12]。本研究通過鷺鷥草花序軸無菌離體培養，誘導不定芽，從而建立鷺鷥草組織培養再生體系，可以高效快速地繁殖種苗，緩解野生資源瀕危的現狀，為鷺鷥草產業大規模發展提供種苗以及技術支撐，對該物種的可持續利用具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

供試材料由重慶市林業科學研究院提供，鷺鷥草植株為從酉陽縣引種至溫室大棚馴化栽培的成熟植株。2019年7月上旬，選取健康植株的未開放花序軸為外植體（圖1）。

1．2 方法

1．2．1 花序軸的無菌處理

以未開放花序軸為外植體，剝去花萼，1/1 000肥皂水溶液震蕩清洗兩遍后流水漂洗干凈，放入75%的酒精溶液浸泡10 s，再以1/1 000 氯化汞（Hg?Cl2）溶液震蕩消毒（表1）。無菌水清洗3 遍后瀝干水分，切出新的接觸面接種于MS 培養基。每個消毒處理50 段，每瓶接種1 段，重復3 次，1 800 lx 光照下（25±1）℃培養，光照時間為每天12 h，15 天后統計花序軸污染率、死亡率和成活率。

1．2．2 不定芽誘導

將獲得的無菌花序軸段轉接入誘導培養基（表2）。每瓶接種1段，每個配方60瓶，3個重復。置于1 800 lx 光照下，光照時間為每天12 h，（25±1）℃室溫下培養25 ～40 天。統計出芽數和誘導周期，記錄芽長勢，計算誘導率。

圖1 未開放花序軸Fig.1 Unopened rachis

1．2．3 不定芽的增殖培養

待不定芽長至1．5 ～2 cm 左右，切下轉入增殖培養基（表3）。每瓶4 個芽，10 個重復。和不定芽誘導培養條件一致，培養25 ～35天。統計增殖的小芽個數及小苗長勢，記錄葉片顏色，計算增殖系數。

1．2．4 壯苗培養

增殖苗長至1．5 ～2 cm，即可轉接入壯苗培養基（表4）。每瓶10 株，5 個重復。和不定芽誘導培養條件一致，培養20 天。觀察對比小苗長勢、葉色轉綠程度、葉片健壯程度及舒展程度。

1．2．5 生根培養

挑選高度2 ～3 cm 的健壯小苗，切成單芽轉接入生根培養基（表5）。每瓶10 株，5 個重復。置于1 800 lx 光照下，光照時間為每天12 h，（28 ± 1）℃下培養30 天。統計分析生根周期和生根率，觀察根部生長狀態（生根數量、粗細程度、整齊度）及小苗長勢。生根周期為轉接入生根培養基到開始出現白色根點的時間。

1．2．6 煉苗移栽

小苗根長至1．5 ～2．0 cm，即可煉苗移栽。洗凈根部瓊脂，用1/1 000多菌靈（50%可濕性粉劑）浸泡15 min，即可進行移栽。基質為草炭、珍珠巖和沙以3∶1∶0．5（體積比）的比例混合均勻，定植于32 孔穴盤中，澆透生根水（LS7，不添加卡拉膠和蔗糖），罩上塑料薄膜，置于（25 ± 1）℃室溫下，通風半遮陰。3 天后每天半揭膜透氣1 h，6 天后全揭膜，保持基質濕潤，長出新根后噴施1/1 000 磷酸二氫鉀溶液，小苗長高至10 ～15 cm，即可換盆移栽定植。統計移栽成活率。

圖2 花序軸培養出的種子Fig.2 Seed cultured on rachis

圖3 誘導的不定芽Fig.3 Induced adventitious shoots

圖4 增殖叢芽Fig.4 Proliferative cluster shoots

圖5 壯苗培養前Fig.5 Before strong seedling culture

1．3 數據處理

采用Excel 2007 和SPSS v17．0 軟件進行統計分析和方差分析。

2 結果與分析

2．1 無菌材料的獲得

在其他處理相同的情況下，隨著流水沖洗和HgCl2消毒處理時間的增加，污染率下降，死亡率上升（表1）。 除了P1 處理，其他處理的污染率均在50%以下。在同樣的流水沖洗時間下，增加HgCl2消毒時間，污染率顯著下降（P＜0．05），死亡率顯著上升（P＜0．05），成活率先增后降，在消毒8 min時達到最高，之后顯著下降（P＜0．05），因此HgCl2消毒時間不宜超過8 min；相比同一HgCl2消毒時間下增加流水處理時間，其污染率下降更顯著，但死亡率大幅上升。P5 處理的污染率和死亡率較低，分別為15．33%和16．00%，成活率最高（68．67%）。

圖6 壯苗培養后Fig.6 After strong seedling culture

圖7 生根培養Fig.7 Rooting culture

圖8 組培幼苗移栽20天后Fig.8 20 Days after transplanting of tissue culture seedlings

表1 不同消毒處理對鷺鷥草無菌培養的影響Tab.1 Effects of different sterilization treatments on aseptic culture of D.major

續表1 Continued

2．2 不定芽的誘導

MS 培養基附加一定量的6-BA 和NAA 處理均可誘導出不定芽（表2）。同時添加6-BA 和NAA 處理（L2、L3、L5、L6、L8和L9）的誘導率顯著高于僅添加NAA 處理（L1、L4 和L7）（P＜0．05）。L5 和L6 處理的誘導率最高（93．33%），不定芽長勢較好。 同時添加6-BA 和NAA，當NAA 濃度相同時，隨著6-BA 濃度的增加，誘導周期逐漸縮短；當6-BA 濃度達到2．5 mg/L 時，誘導出的不定芽長勢較差，葉色黃白或黃綠。當6-BA 濃度相同時，隨著NAA 濃度增加，誘導周期不斷下降；除了2．0濃度外，其他濃度處理的誘導率均隨著NAA 濃度增加呈先上升后下降的趨勢；不添加NAA 時，不定芽均呈現黃白色，長勢差或較差，隨著NAA 濃度增加，長勢好轉，而當濃度達到0．50 mg/L 時，不定芽長勢又轉差。 L2、L3 和L5 處理在轉接后結出了果實（圖2）。綜合考慮，最適宜的不定芽誘導配方為L5 處理（MS+2．0 mg/L 6-BA+0．25 mg/L NAA），誘導時間為31．97 天，誘導率為93．33%，不定芽長勢良好，呈嫩綠色（圖3）。

表2 不同培養基處理對鷺鷥草不定芽誘導的影響Tab.2 Effects of different culture medium treatments on adventitious shoot induction of D.major

2．3 不定芽的增殖培養

僅添加6-BA和NAA處理（LZ1 ～LZ9）的增殖系數為4．21 ～5．63；同時添加6-BA、NAA 和KT 處理（LZ10 ～LZ17），除LZ16 增殖系數稍低（5．60），其他處理的增殖系數均高于5．63，最高可達7．12（LZ13），表明添加KT對增殖有一定的促進效果（表3）。未添加KT時，在NAA濃度相同的情況下，隨著6-BA濃度的上升，小苗的長勢呈下降趨勢；在6-AB 濃度相同的情況下，隨著NAA 濃度的上升，增殖系數下降；當6-AB 濃度達到2．50 mg/L、NAA 濃度達到0．60 mg/L時，小苗出現一定程度的玻璃化。添加KT 的處理中，處理LZ10 ～LZ13 比處理LZ14 ～LZ17 增殖系數高，長勢也相對較好，可見過高的激素濃度會抑制鷺鷥草的增殖和生長，NAA 濃度宜在0．20 mg/L 以下，6-BA 濃度不宜高于2．00 mg/L。最適宜的增殖培養配方為處理LZ12（MS 培養基+ 1．50 mg/L 6-BA +0．10 mg/L NAA+0．75 mg/L KT），增殖系數可達6．8，小苗較健壯，葉色嫩綠（圖4）。

表3 不同培養基處理對鷺鷥草增殖培養的影響Tab.3 Effects of different culture medium treatments on multiplication culture of D.major

2．4 壯苗培養

增殖培養的小苗較弱，葉色整體偏黃綠色，葉片舒展度不高，直接轉入生根培養基中會出現黃葉現象（圖5）。 添加土豆汁和硝酸銨（NH4NO3）均可促進小苗葉色轉綠及葉片舒展，加快長勢（表4）。添加土豆汁對小苗健壯程度影響較大；添加NH4NO3則對葉色轉綠及葉片舒展程度影響較大；兩者共同作用，效果更佳。在MS培養基上同時添加20 g/L 土豆汁和NH4NO3為最佳壯苗培養配方，小苗長勢良好，健壯，葉色翠綠且舒展度高（圖6）。

表4 不同培養基處理對鷺鷥草苗生長的影響Tab.4 Effects of different culture medium treatments on growth of D.major seedlings

2．5 生根培養

轉入生根培養基，15．30 ～25．09天即可生根（表5）。 僅添加NAA 或IBA 的處理中，添加NAA 處理（LS1 ～LS3）的生根率均高于添加IBA 處理（LS4 ～LS6），LS1 和LS2 處理的生根率顯著高于LS4、LS5和LS6 處理。 對比LS1 ～LS3 和LS4 ～LS6，還可以發現僅添加IBA 的組別，須根更粗壯，根條數更多，根長勢更整齊；而添加NAA 的組別小苗長勢更快，根更長。 同時添加NAA 和IBA 處理（LS7 ～LS9）較單一激素處理的生根效果更好，生根周期短，根粗壯且長度適中，小苗長勢快且粗壯。 LS7 處理（1/2 MS+ 0．50 mg/L IBA + 0．20 mg/L NAA）的效果最好，生根率高達100%，17．16 天即可生根，平均生根數為7．94條，根粗壯且整齊，小苗長勢快（圖7）。

表5 不同培養基處理對鷺鷥草生根的影響Tab.5 Effects of different culture medium treatments on rooting of D.major

2．6 煉苗移栽

將組培瓶苗洗凈根部瓊脂后，進行簡單消毒即可直接移栽。種下后，約3天可長出新根，20 天左右可進行換盆移栽，移栽成活率達100%。 當生根苗根部長度過長時（2 ～3 cm 以上），會造成盤根現象，長出新根需要4 ～6 天，只需保持基質濕潤，避免陽光直射，遮陰達到50%，嚴格掌握好揭膜時間，移栽成活率也可達到100%（圖8）。

3 結論與討論

無菌材料的獲得是無性系繁殖成功至關重要的一步。鷺鷥草花序軸花朵與軸的連接處被花萼包裹，容易造成消毒不徹底，導致污染。本試驗結果表明，適當增加流水沖洗時間，可在一定程度上降低污染率，可作為結構復雜、組織嬌嫩、不耐受HgCl2材料的有效消毒預處理方式之一，也更加低碳環保。

在誘導過程中，L1、L2 和L3 處理均出現結實現象。李娜等[13]研究發現不同時期的花序軸再生能力與分化方向存在差異。本研究中的花序軸在誘導培養過程中出現結實和不定芽的不同結果，是否與激素種類和濃度配比有關[14]，或是不同生長階段差異造成，目前機制尚不明確。

Filippova 等[15]在繼代培養中發現，較高濃度的KT（5 mg/L）有利于百合科植物的增殖，Tao 等[16]發現，添加KT 和NAA 后，岷江百合（Lilium regale）的不定芽誘導率達到100%，說明KT 對于百合科植物的增殖培養有良好效果，本研究也得到相同的結果。在整個組織培養過程中，當NAA 含量超過0．25 mg/L 時，小苗長勢減弱，葉片出現黃化現象，與Johnson 等[17]的結論一致。較低濃度的生長激素更適合鷺鷥草組織培養，加入KT 后增殖效果更好。

在鷺鷥草生根培養階段，單獨添加NAA 處理比添加IBA 處理生根率高，與蔣瑤等[18]研究結果一致。同時使用NAA和IBA，生根效果更好。

本研究中，鷺鷥草的生根率較高，在移栽過程中澆透生根水后，無根的幼苗也陸續長出了新根，且長勢良好。 瓶外生根可以有效地降低生產成本和生產周期[19]，并在無性繁殖育苗中運用廣泛[20-22]，后期可開展鷺鷥草瓶外生根研究，進一步優化鷺鷥草無性高效快繁體系。