HMGB3對胎兒生長受限患者胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及凋亡的影響與機(jī)制分析

（西北婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)二科，西安 710061）

胎兒生長受限（FGR），也稱為宮內(nèi)生長受限（IUGR），是指胎兒大小異常，在宮內(nèi)未達(dá)到其遺傳的生長潛能，在我國平均發(fā)病率達(dá)7%，嚴(yán)重增加圍產(chǎn)兒的發(fā)病率和病死率[1]。FGR的病因?qū)W非常復(fù)雜，目前還未能完全闡明。傳統(tǒng)上FGR的影響因素主要為孕婦因素、胎盤因素、臍帶因素、胎兒因素等，其中胎盤的位置或形態(tài)異常可能是導(dǎo)致FGR的重要的因素[1]。研究[2-4]表明，多種生物學(xué)過程參與FGR的發(fā)生過程，如滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡增加、氧化應(yīng)激、螺旋動脈重建不足及血管生成異常。胎盤功能的完整是胎兒生長和發(fā)育的決定性條件，它是母體與胎兒之間營養(yǎng)與廢物交換的場所。胎盤中一些激素和生長因子的代謝和產(chǎn)生也可調(diào)節(jié)胎兒生長和母體生理[5]。如胰島素樣生長因子（IGF）-I和IGF-II具有潛在的致有絲分裂活性，其在不同的胎盤表面均有表達(dá)，并誘導(dǎo)體細(xì)胞生長和增殖[5]。另外還有許多其他重要的蛋白分子參與調(diào)控胎盤的生長和發(fā)育。這些蛋白的表達(dá)異常也可能會影響胎盤的功能，這在FGR的發(fā)生中占重要的作用。高遷移率蛋白（HMGB）具有特殊的DNA結(jié)合區(qū)域（HMG-box），可與DNA高度結(jié)合，影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，使DNA發(fā)生折疊，在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組、DNA修復(fù)、基因組穩(wěn)定性等染色質(zhì)的多種過程中發(fā)揮重要的作用[6]。一項(xiàng)從正常和FGR患者的胎盤組織中構(gòu)建的大規(guī)模比較蛋白質(zhì)組譜表明HMGB3在FGR胎盤中顯著下調(diào)[7]。除上述功能外，HMGB還能與其他轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白相互作用。但是目前對于HMGB在FGR胎盤中的病理機(jī)制及其相互作用的蛋白的研究相對較少。本研究旨在探討HMGB在FGR胎盤中的功能及潛在作用機(jī)制，以期為FGR的治療提供新的理論基礎(chǔ)和靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月－2019年1月在西北婦女兒童醫(yī)院住院分娩的90例產(chǎn)婦，49例健康產(chǎn)婦為正常組，41例FGR患者為FGR組。診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》[8]。2組年齡、孕周等一般資料比較無顯著差異，2組均無原發(fā)性高血壓、腎炎、糖尿病等其它疾病。在分娩后收集2組胎盤組織，從胎盤的母體側(cè)取3.0g組織，迅速置于液氮中速凍，之后保存于-80℃直至實(shí)時熒光定量PCR檢測。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo購自北京北納生物公司，將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)。取3～4代生長良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于6孔板，孵育過夜。采用脂質(zhì)體2000（上海碧云天公司）將2.5μg的HMGB3過表達(dá)質(zhì)粒（HMGB3組）或空質(zhì)粒（pcMV6-XL5，對照組）分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24h后，分別采用實(shí)時熒光定量PCR和WesternBlot法檢測轉(zhuǎn)染效率。過表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒均購自美國OriGene科技公司。

1.4 細(xì)胞增殖檢測

采用上海碧云天公司的CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒檢測各組細(xì)胞的增殖活性。將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞以每孔1×103個的密度接種于96孔板，孵育24h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測吸光值（OD）。每組設(shè)4個復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

收集轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）染色，采用Kaluza流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）檢測細(xì)胞凋亡率，用CellQuest軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，激發(fā)波長為488nm。每組重復(fù)3次，取均值。

1.6 細(xì)胞遷移檢測

采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞的遷移能力。收集轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，以每孔4×105個的密度接種于6孔板，每孔加入2.5mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，用移液器在細(xì)胞表面劃1條直線，培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度。細(xì)胞遷移率（%）= （劃痕即刻寬度-劃痕48h寬度）/劃痕即刻寬度×100%。

1.7 生物信息學(xué)方法

采用String生物信息數(shù)據(jù)庫分析與HMGB3相互作用的蛋白，并統(tǒng)計歸納這些蛋白參與的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分。String數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=iGaB3N2IcuYy&input_page_show_search=on。

1.8 實(shí)時熒光定量PCR

采用Trizol試劑從轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞中提取總RNA，取1μg總RNA，以RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成第一次鏈cDNA，用BeyoFast?SYBR GreenqPCRMix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。GAPDH為內(nèi)參，試劑盒均購自上海碧云天公司，引物均由上海生工公司設(shè)計并合成。

1.9 免疫共沉淀

采用RIPA試劑從轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞中提取總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。將20 μL瓊脂糖微珠A/G加入至100μg的總蛋白中，4℃預(yù)漂洗30min，之后用PBS洗3次。加入兔HMGB3多抗（1:500，賽默飛世爾中國），4℃孵育2h，加入40μL瓊脂糖微珠A/G，4℃孵育結(jié)合過夜，之后用PBS洗3次，加入20μL2×蛋白上樣緩沖液，混勻后95℃變性5min，之后進(jìn)行WesternBlot檢測。

1.10 Western Blot

采用上述免疫共沉淀步驟提取總蛋白及蛋白定量分析。將20μg總蛋白加入上樣緩沖液中，用10% SDS-PAGE凝膠分離，之后將總蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% BSA封閉45min，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗3次，每次5min。之后采用電化學(xué)發(fā)光試劑ECL于暗室發(fā)光，采用ImageJ軟件分析及處理?xiàng)l帶。GAPDH為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間對比采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HMGB3的預(yù)測結(jié)合蛋白及其功能聚類分析

如圖1所示，根據(jù)String軟件預(yù)測，與HMGB3相互結(jié)合的蛋白共有10個，分別為NDNL2（抑蛋白樣蛋白2）、HMGN2（高遷移率族核小體結(jié)合域2）、NUMA1（核有絲分裂器蛋白1）、NUCKS1（核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1）、GM2A（GM2神經(jīng)節(jié)苷脂激活蛋白）、H2AFZ（H2A組蛋白家族成員Z）、SUPT16H（SPT16同源蛋白，促進(jìn)染色質(zhì)重構(gòu)亞基）、SSRP1（結(jié)構(gòu)特異性識別蛋白1）、BTAF1（B-TFIIDTATA-box結(jié)合蛋白相關(guān)因子1）和NPL（N-乙酰神經(jīng)氨酸丙酮酸裂解酶）。根據(jù)String軟件中的GO分析對這11個蛋白（包括HMGB3）的功能進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如表1所示。GO生物學(xué)過程分析：5個參與DNA代謝過程，4個參與DNA修復(fù)過程，3個參與DNA重組過程，3個參與DNA復(fù)制過程。GO分子功能分析中：3個為核小體結(jié)合蛋白，5個為染色質(zhì)結(jié)合蛋白，2個為核小體DNA結(jié)合蛋白，4個為含蛋白質(zhì)的復(fù)合物結(jié)合蛋白，6個為DNA結(jié)合蛋白。GO細(xì)胞成分分析中：8個參與染色體組成，4個參與染色體部分組成，8個參與胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)腔組成，7個參與核內(nèi)腔組成，9個參與細(xì)胞核組成，3個參與染色質(zhì)組成。

圖1 String軟件預(yù)測分析HMGB3的結(jié)合蛋白

表1 HMGB3結(jié)合蛋白的功能聚類分析

2.2 2組胎盤組織中HMGB3 mRNA 相對表達(dá)量比較

見表2。

表2 2組胎盤組織中HMGB3 mRNA 相對表達(dá)量比較

2.3 2組細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的比較

見表3。

表3 2組細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的比較

2.4 2組HMGB3結(jié)合蛋白mRNA 的表達(dá)

見表4。

表4 2組HMGB3結(jié)合蛋白mRNA的表達(dá)

2.5 2組HMGB3與其結(jié)合蛋白的相互作用情況比較

見表5。

表5 2組HMGB3與其結(jié)合蛋白的相互作用情況比較

3 討論

在孕早期，由于胎盤絨毛發(fā)育不完善，導(dǎo)致胚胎與母體血液之間的物質(zhì)交換尚未完全建立，因此胚胎發(fā)育及滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮基質(zhì)的過程是在一個相對缺氧的環(huán)境下進(jìn)行的，缺氧環(huán)境是有利于滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖[9]。研究表明，在FGR的胎盤中可觀察到許多組織病理學(xué)變化，包括絨毛形態(tài)變化、絨毛梗塞和母體血管變化[10]，表明胎盤功能障礙可能是FGR的重要原因之一。因此，本研究首先觀察了HMGB3在FGR胎盤中的表達(dá)。與正常胎盤相比，HMGB3mRNA相對表達(dá)量在FGR胎盤中表達(dá)下調(diào)。隨后的體外實(shí)驗(yàn)也表明HMGB3過表達(dá)可以促進(jìn)HTR-8/SVneo滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移，同時抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡。此結(jié)果與先前關(guān)于HMGB3在腫瘤細(xì)胞中的功能的研究一致[11]。研究結(jié)果表明，胎盤中HMGB3蛋白的異常低表達(dá)導(dǎo)致的滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，可能是促進(jìn)FGR發(fā)展的原因之一。

為探討HMGB3對滋養(yǎng)層細(xì)胞功能影響的機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫String進(jìn)行HMGB3相關(guān)結(jié)合蛋白的預(yù)測，結(jié)果顯示，與HMGB3相結(jié)合的蛋白有10個，分別為NDNL2、HMGN2、NUMA1、NUCKS1、GM2A、H2AFZ、SUPT16H、SSRP1、BTAF1和NPL。對這些蛋白進(jìn)行GO3個本體的功能聚類分析后發(fā)現(xiàn)，這10和蛋白基本均在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，且大部分參與染色體的功能及組成，其中NDNL2、NUCKS1、SUPT16H和SSRP1這4個蛋白的功能與HMGB3一致，參與DNA的代謝、修復(fù)、重組和復(fù)制等過程。為驗(yàn)證滋養(yǎng)層細(xì)胞中HMGB3與其預(yù)測蛋白的結(jié)合情況，本研究采用免疫共沉淀法，用HMGB3抗體捕獲，然后依次用IgG（Input）、HMGB3、NDNL2、HMGN2、NUMA1、NUCKS1、GM2A、BTAF1、SUPT16H、SSRP1、H2AFZ和NPL抗體進(jìn)行共沉淀，以此驗(yàn)證及反映HMGB3與其預(yù)測蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB3過表達(dá)可顯著抑制其與NDNL2蛋白的結(jié)合，可顯著增加其與HMGN2、NUMA1、NUCKS1、BTAF1、SUPT16H、SSRP1、H2AFZ蛋白的結(jié)合，對其與GM2A和NPL蛋白的結(jié)合無顯著影響。實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，HMGB3過表達(dá)抑制NDNL2mRNA的表達(dá)，增 加HMGN2、NUMA1、NUCKS1、BTAF1、SUPT16H、SSRP1、H2AFZmRNA的 表 達(dá)，對GM2A和NPLmRNA的表達(dá)無影響。因此，依照HMGB3對這些蛋白的調(diào)節(jié)作用，將這10個蛋白分 為3類： 上 調(diào)，HMGN2，NUMA1，NUCKS1，BTAF1，SUPT16H，SSRP1，H2AFZ；下調(diào)，NDNL2；無影響，GM2A和NPL。

本研究進(jìn)一步分析這些蛋白分子的相關(guān)功能。HMGN2和NUCKS1都屬于高遷移率蛋白（HMG）家族成員，參與組織器官發(fā)育、染色體活性調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)等多方面功能，此外NUCKS1還能被第二信使激活[12-13]，雖然目前關(guān)于FGR中HMGB3與HMGN2和NUCKS1蛋白相互結(jié)合調(diào)控的研究甚少報道，但從本研究的結(jié)果來看，HMGB3下調(diào)導(dǎo)致的HMGN2和NUCKS1抑制可能在FGR的致病過程中發(fā)揮重要作用。NUMA1為核有絲分裂器蛋白，是一種負(fù)責(zé)紡錘體極裝配的蛋白質(zhì)，對細(xì)胞分裂的完成起非常重要的作用[14]。FGR中HMGB3下調(diào)可能會導(dǎo)致NUMA1下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致有絲分裂紡錘體異常，染色體排列異常，這些異常將直接影響胚胎的正常發(fā)育。BTAF1作為轉(zhuǎn)錄因子，可以與TATA結(jié)合蛋白（TBP）相互作用形成B-TFIID復(fù)合體，在RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15]。轉(zhuǎn)錄和翻譯過程是合成結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白重要的過程，在胚胎發(fā)育、器官生長等過程中占據(jù)重要的地位。FGR過程中HMGB3誘導(dǎo)的BTAF1表達(dá)抑制可能也是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄受阻，胚胎生長受限的原因之一。SUPT16H和SSRP1是一種組蛋白伴侶FACT復(fù)合物的2個亞基，能夠在以染色質(zhì)為模板的相關(guān)轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用，可幫助組蛋白重新組裝到DNA上，以維持染色質(zhì)的穩(wěn)定性[16]。因此FGR中HMGB3下調(diào)導(dǎo)致的SUPT16H和SSRP1表達(dá)降低可能會破壞胚胎染色質(zhì)穩(wěn)定性。H2AFZ是組蛋白H2A變異體，為高度保守的組蛋白變異體，可在不同的細(xì)胞周期建立特殊的核小體結(jié)構(gòu)來替換核心組蛋白，參與保護(hù)常染色體，防止形成異染色質(zhì)，對基因組的穩(wěn)定性也具有保護(hù)作用[17]。FGR中HMGB3介導(dǎo)的H2AFZ表達(dá)下調(diào)也可能是導(dǎo)致胚胎發(fā)育受限的重要原因。此外，NDNL2是一種神經(jīng)元特異性的生長抑制因子[18]，本研究FGR中HMGB3下調(diào)可能導(dǎo)致NDNL2表達(dá)增加，抑制胚胎神經(jīng)元生長發(fā)育，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育受限。GM2A和NPL雖然在String軟件中預(yù)測可與HMGB3結(jié)合，但是本研究采用實(shí)時定量PCR和免疫共沉淀法檢測出，在滋養(yǎng)層細(xì)胞中HMGB3過表達(dá)對GM2A和NPL的表達(dá)與無顯著影響。總之，大部分HMGB3的結(jié)合蛋白參與DNA、組蛋白、染色質(zhì)等的生物活動過程，在FGR中這些蛋白的表達(dá)異常將是導(dǎo)致胎兒生長受限、胎兒發(fā)育障礙的重要的原因。當(dāng)然具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但希望本研究能夠?yàn)橐院笱芯刻荷L受限方面提供新的思路。

綜上所述，HMGB3在FGR患者胎盤組織中低表達(dá)，且HMGB3過表達(dá)可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及遷移，抑制凋亡。HMGB3介導(dǎo)的DNA、組蛋白、染色質(zhì)等活動異常可能是導(dǎo)致FGR發(fā)病的機(jī)制之一。