全視場光學相干層析技術的角膜高分辨率成像

肖鵬，Viacheslav Mazlin，袁進

(1.中山大學中山眼科中心，廣州 510060；2.朗之萬研究所，法國 巴黎)

角膜是位于眼球最前端的光學透明組織，是清晰視覺形成的前提與基礎。角膜疾病是全球主要的致盲性眼病，每年造成150萬～200萬人失明，且90%以上的受影響人口生活在發展中國家[1-3]。角膜疾病嚴重影響人民群眾的眼健康和生活質量，是涉及民生的重大公共衛生問題和社會問題。角膜成像技術通過提供角膜的結構和功能圖像，能夠幫助臨床醫生獲取更全面的疾病信息，在角膜疾病的診斷和治療中具有無可取代的作用。發展高分辨率活體角膜成像技術，對角膜細胞結構進行更精準有效的分析，是眼科學及影像學交叉領域的重要研究問題。

目前，應用在臨床活體角膜檢測的傳統成像技術主要有裂隙燈生物顯微鏡(slit lamp biomicroscopy，SLB)，活體共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy，IVCM)和光學相干層析技術(optical coherence tomography，OCT)等。SLB是角膜臨床活體檢測時最常使用的非接觸性成像設備，通過調節焦點和光源寬窄，形成“光學切面”，能用于觀察表淺及深層的角膜病變。但是受制于光學成像原理和放大倍率，SLB的成像分辨率有限，無法觀測到角膜的細胞結構[4]。IVCM是一種逐點掃描并利用空間針孔調制來去除樣品非焦點平面的散射光以提高光學分辨率和視覺對比度的臨床角膜活體成像方法，它具有的微米級別高平面分辨率足以觀察角膜組織中的單個細胞甚至細胞核[5-7]。然而，受設備掃描速率和眼球運動的限制，IVCM在活體角膜高分辨率成像中的成像視野非常有限，一般不超過400 μm×400 μm。OCT是20世紀90年代初發展起來的一種新型斷層成像技術[8-9]。它利用不同組織結構對光的反射率不同，使用近紅外弱相干光照射待測組織，依據光的相干性產生干涉來獲得組織的斷層圖像，從而獲得組織的內部結構形態。OCT具有非接觸性、快速成像、高探測靈敏度等特點，在角膜疾病的基礎研究、臨床診斷、鑒別診斷和療效跟蹤觀察[10-14]等方面被廣泛應用。然而，由于傳統OCT是通過檢測沿光軸景深各點反射的信號來獲取圖像，為保證足夠的成像深度，OCT一般采用數值孔徑較小的顯微物鏡，因此傳統OCT在提供具有高軸向分辨率的橫斷面圖像的同時，無法提供具有高平面分辨率的細胞平面(en face)結構圖像[9]。

全視場光學相干層析技術(full-field optical coherence tomography，FFOCT)是OCT的一種變體。FFOCT使用寬帶空間非相干光源(LED等)，通過光學相干切片功能檢測給定深度相干平面的反射信號，利用面陣相機(CCD/CMOS camera)直接獲得大視野的二維平面圖像，通過對樣本沿深度進行掃描獲取三維圖像[15-16]。FFOCT成像技術結合了傳統OCT的非接觸三維成像、大成像視野和高軸向分辨率的優勢以及IVCM的高平面分辨率的特點。隨著技術的發展和對原始儀器的改進，FFOCT已經顯示出了超越很多飛秒激光系統的分辨能力[17]。前期研究[18]結果證明：由于使用了空間非相干光源，FFOCT的空間分辨率不受幾何相差的影響，而只降低系統的成像信噪比。隨著現代醫學及影像技術的發展，眼科學基礎研究和角膜疾病的臨床診療對角膜成像技術的需求正從傳統形態結構成像向高分辨率結構及功能成像過渡。將FFOCT應用到活體角膜成像中，將能實現角膜的非接觸性、大成像視野、高分辨率細胞成像，提供更豐富、更全面的高分辨率角膜結構和功能的信息，使醫生在角膜疾病的精確診斷、精準治療及深入的病因病理研究方面的追求得以更好的實現。

本研究針對當前角膜成像的重大需求及高分辨率活體成像技術研究的發展趨勢，創新性設計并構建活體角膜成像高分辨率FFOCT系統，采用高數值孔徑顯微物鏡及高速面陣相機，實現細胞級別成像分辨率及大成像視野。通過對健康人眼活體角膜進行高分辨率FFOCT成像，驗證其臨床應用價值，為開發新一代活體高分辨率角膜成像平臺奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 對象

為驗證FFOCT系統在活體人眼角膜成像中的質量，我們使用設備對1位27歲健康男性志愿受試者的角膜進行了活體角膜FFOCT成像實驗。受試者自愿簽署知情同意書，所有程序符合赫爾辛基宣言(1983年)。本研究內容已獲得法國人事保護委員會CPP(Comité de Protection de Personnes) Sud-Est III de Bron和國家藥品和健康產品安全局ANSM(Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des Produits de Santé)批準(批準號：2019-A00942-55)。FFOCT成像實驗前，對受試者進行了包括裂隙燈觀察、眼壓測量等常規的眼科檢查。FFOCT成像時，受試者將下頜固定于頜托上，上額緊貼額托，非成像眼注視視標，保持穩定。通過調節設備高度及成像位置，分別對受試者角膜中央各深度進行FFOCT圖像采集。相機采集頻率設定為550 fps，每個成像深度通過雙相位調制模式采集10張FFOCT圖像。完成采集后，10張FFOCT圖像通過ImageJ的圖像配準插件[19]進行眼動導致的平面抖動配準、疊加平均后獲得最終的活體角膜FFOCT圖像。為了和所采集FFOCT影像作對比，我們利用接觸式IVCM設備(HRT II with Rostock cornea module;Heidelberg Engineering，GmbH)采集了受試者角膜中央不同深度的IVCM影像。

1.2 方法

1.2.1 FFOCT 活體人眼角膜成像系統光學設計

如圖1 所示，FFOCT活體人眼角膜高分辨率成像系統是基于林尼克干涉儀的顯微鏡成像系統。系統設計使用中心波長為850 nm發光二極管(Light-emitting Diode，LED，M850LP1，Thorlabs，USA)作為空間非相干寬帶光源。LED的光穿過非球面聚光透鏡后由立方體分光器以50:50的相等分光比分別照入FFOCT系統的樣本臂(Sample arm)和參考臂(Reference arm)。在樣本臂和參考臂中，光均通過相同的顯微鏡物鏡分別聚集在人眼角膜和反射鏡上。使用數值孔徑NA=0.3的干燥顯微物鏡(Olympus，Japan)，在非接觸成像方式下提供1.7 μm的理論橫向分辨率(瑞利標準，Rayleigh Criterion)。參考臂反射鏡安裝在壓電制動器(piezoelectric transducer，PZT)上。系統樣本臂中從人眼角膜不同深度向后散射的光信號和參考臂中反射鏡反射的光信號由立體分光器重新組合通過相機聚焦透鏡(f=250，Thorlabs，USA)最后由大滿阱容的CMOS面陣相機(Q-2A750-CXP，Adimec，Netherlands)檢測成像。

圖1 FFOCT活體人眼角膜高分辨率成像系統光路設計圖Figure 1 Schematic of the in vivo human corneal imaging FFOCT system

1.2.2 FFOCT 系統光照安全評估

FFOCT系統將采用的是近紅外光源，中心波長為850 nm。由于視網膜對近紅外光波的敏感度低，患者可以輕松地觀察到光照但不會造成對視網膜的光化學損傷(Photochemical damage)。針對我們系統所設計使用的光源和照明模式，基于眼科設備光照安全標準(美標ANSI Z80.36-2016)，即使考慮長時間的連續照明模式下，在眼底產生的視網膜照射量也遠遠低于標準所規定的最大允許照射量(maximum permissible exposures，MPEs)：

同樣對于角膜的照射量及時考慮連續照明的模式，也是低于標準所規定的MPEs的：

而為了提高患者在實驗過程中的舒適性，系統采用的照明模式為均勻的 脈沖調制模式。在相機運行頻率550 fps的情況下，最終平均10張平面圖來獲得最終FFOCT圖像，脈沖時間34 ms，暫停時間1 000 ms的調制模式。大大降低光照對角膜及視網膜的照射量，增加系統的光照安全性。

1.2.3 雙相位調制FFOCT 活體角膜圖像處理

在FFOCT系統中使用的寬帶空間非相干光源保證了系統的干涉僅僅發生于角膜中來自相干平面內的散射光信號。如圖2所示，為了提取相干平面內的干涉信號并剔除不需要的非相干部分，系統采用了雙相位調制(two-phase modulation)方案，利用位于參考臂反射鏡后PZT對參考臂光程引入相位差等于的光程步進調制，同時CMOS相機進行同步圖像采集原始圖像I1，I2：

為提高圖像質量，在同一成像深度采集處理多張平面圖像，并對圖像進行平均處理以獲得更好的最終FFOCT圖。在活體角膜成像中，為了提高系統成像幅頻，改善眼動對成像質量的影響，高速CMOS相機的采樣輻頻為550 fps。對眼球運動造成多張圖像之間的成像位置的微小差異，采用圖像組的互相關處理，完成多張圖像的位置的配準，最終進行平均疊加以提高FFOCT圖像的信噪比。

圖2 FFOCT雙相位調制圖像處理原理圖Figure 2 FFOCT two-phase modulation image processing principle

2 結果

FFOCT活體角膜圖像能清楚分辨包括淚膜、角膜上皮層、基底下神經叢神經纖維、角膜基質層基質細胞及神經、角膜內皮層內皮細胞等正常角膜結構(圖3)。FFOCT上層角膜影像中，基底下神經纖維表現為高反射線型，同其在IVCM中的影像表現相似(圖3A)；FFOCT可以分辨出角膜上皮層結構，但是，由于淚膜及基底下神經叢結構的高反射信號干擾，FFOCT影像暫無法區分角膜上皮鱗狀細胞、翼狀細胞及基底細胞結構。FFOCT在中層角膜的影像清晰的顯現出角膜基質層的基質細胞結構及基質層神經節連接多跟神經纖維(圖3B)。FFOCT深層角膜影像中，可見深層角膜基質細胞結構及角膜內皮高反射信號；從放大區域的FFOCT角膜內皮影像中，可以清楚分辨健康角膜六邊形內皮細胞結構的緊密排布(圖3C)。

圖3 FFOCT活體健康人眼角膜圖像Figure 3 FFOCT image of in vivo healthy human cornea

3 討論

本文創新性設計并構建了基于FFOCT的高分辨活體人眼角膜成像系統，并對健康人眼角膜進行了成像實驗驗證其性能。針對FFOCT系統成像速度及成像質量對樣本運動的敏感性問題，采用高數值孔徑干燥顯微物鏡及高速面陣相機，提高系統成像速度，改善活體成像時眼動對成像質量影響，實現非接觸成像方式下獲取活體人眼角膜的細胞級別平面分辨率FFOCT影像。FFOCT活體人眼角膜成像系統的平面分辨率為1.7 μm，和目前臨床使用的角膜細胞結構成像技術IVCM相當。但是與IVCM相對局限的成像視野(400 μm×400 μm)相比，FFOCT的成像視野達到1.26 mm×1.26 mm，能夠一次性獲得更大范圍內的角膜高分辨率結構信息。此外，FFOCT的非接觸成像方式，相比IVCM接觸性的成像方式且成像前需對病患進行眼表麻醉，降低了成像過程中角膜感染以及角膜上皮損傷的風險，在一些特殊場景，如角膜疾病檢測和術后評估中具有一定的優勢。針對后期大范圍的臨床應用驗證，該FFOCT高分辨率活體人眼角膜成像系統仍需要進一步優化成像采集模式，減少單張圖像所需疊加次數，提升成像速度以期實現精準的三維成像，在提供高分辨率平面信息的同時，增加高分辨率縱向結構信息。