SPC25在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用

汪德秀，王 豐，徐 強(qiáng)，孫孟坊

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325008)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤疾病，常規(guī)手術(shù)、放化療治療效果均不十分理想，其中位生存期不足15個月[1]。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多種致癌基因共同作用的結(jié)果，癌基因的篩查和分析有助于更好地認(rèn)識膠質(zhì)瘤，為膠質(zhì)瘤治療提供新靶點(diǎn)[2-4]。紡錘體極成分25(spindle pole body component 25，SPC25) ，又名著絲粒復(fù)合物成分(NDC80 kinetochore complex component)[5-6]，被認(rèn)為參與著絲粒微管的相互作用和紡錘體檢查點(diǎn)活性的調(diào)控，在肺癌、前列腺癌等腫瘤中均具有促癌作用，但其在膠質(zhì)瘤中尚無研究報(bào)道。本研究觀察SPC25在膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)和對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，以期為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)篩選提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—2014年12月溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的不同級別膠質(zhì)瘤患者90例，其中男55例，女35例，年齡40～65歲，平均年齡(52.9±6.5)歲。根據(jù)WHO病理分級標(biāo)準(zhǔn)[2]，Ⅱ級20例，Ⅲ級32例，Ⅳ級38例。收集同期10例腦外傷患者作為對照組，男6例，女4例，年齡40～65歲，平均年齡(53.7±6.8)歲。2組患者年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所選膠質(zhì)瘤患者均經(jīng)術(shù)后病理診斷確診，患者均不存在已明確的與SPC25表達(dá)相關(guān)的其它疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 材料 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87購自美國ATCC細(xì)胞庫，胎牛血清FBS，DMEM，PBS，0.25%含EDTA的胰酶，1%青鏈霉素均購自Gbico生物科技有限公司。人全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白上樣緩沖液、ECL發(fā)光液等Western blot相關(guān)試劑均購自碧云天生物科技有限公司。免疫組化試劑盒購自福建邁新生物科技有限公司，SPC25抗體、β-actin及HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自CST生物科技有限公司，RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qPCR試劑均購自北京全式金生物科技有限公司。SPC25-siRNA由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，轉(zhuǎn)染試劑lipo3000購自Life invritogen有限公司，MTS試劑盒及結(jié)晶紫染色液購自北京索萊寶凱基生物科技有限公司。

1.3 生物信息學(xué)分析 基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)(https://cancergenome.nih.gov)，采用GlioVis(http://gliovis.bioinfo.cnio.es)數(shù)據(jù)平臺獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中膠質(zhì)瘤患者SPC25的表達(dá)水平、預(yù)后生存時間等臨床資料數(shù)據(jù)，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 Western blot 將膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織進(jìn)行充分研磨、勻漿，或收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用全蛋白提取試劑盒提取組織中的全蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制上樣緩沖液，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，5%奶粉封閉，采用TBST以1∶1 000比例稀釋anti-SPC25、anti-β-actin，4℃孵育過夜(大于12 h)，次日孵育HRP標(biāo)記的二抗，ECL曝光檢測SPC25的表達(dá)情況。

1.5 熒光定量PCR 組織RNA提取：取膠質(zhì)瘤組織充分研磨后，加入1 mL Trizol反復(fù)吹打、充分混勻后轉(zhuǎn)移至無RNA酶的1.5 mL EP 管中，室溫下靜置10 min。隨后加入200 μL氯仿，室溫下劇烈震蕩5 min，4℃ 12 000 g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入500 μL異丙醇，上下顛倒混勻后室溫靜置10 min。4℃ 12 000g 離心10 min，棄上清，向底部沉淀加入1 mL 75% 乙醇吹打洗脫，4℃ 7 500 g離心5 min，棄上清。沉淀室溫下干燥10 min后加入40 μL DEPC水溶解，即為RNA樣品，凍存于-80℃中。細(xì)胞RNA提取：選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞生長至匯合度85%時，用預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細(xì)胞3次，每孔加入1 mL Trizol充分溶解細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同組織RNA提取。隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA，采用熒光定量PCR檢測各組織SPC25的表達(dá)水平。隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA，采用熒光定量PCR檢測各組織SPC25的表達(dá)水平。引物：SPC25:F: 5'- TTTGGTAACAGCGACACGG -3', R: 5'- CGGAGCCAGCAAGGTTT -3'；GAPDH: 5'- TGATAATGAATGTGTAAAAT -3', R: 5'-CCTCTGCCTCCCGGGTTCACAG-3'。

1.6 免疫組化 將膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織立即給予4%的多聚甲醛固定48 h，酒精梯度脫水，二甲苯通透，石蠟包埋。采用4 μm厚度切片，酒精梯度復(fù)水、水化、抗原修復(fù)、去除內(nèi)源性過氧化物酶、封閉后給予anti-SPC25 4℃孵育過夜，次日孵育二抗、鏈霉菌抗生物素蛋白―過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素染色細(xì)胞核，封片，鏡下觀察。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞 將1×106個U87細(xì)胞接種至六孔板中，次日細(xì)胞匯合度至60%～80%時，采用lipo3000分別轉(zhuǎn)染陰性對照(siRNA-NC)和特異性針對SPC25基因的(siRNA-SPC25)，正義鏈序列為：5'-CUUGACCUGUCCAACAACAUU-3',反義鏈序列為3'-UUGAACUGGACAGGUUGUUGU-5'，轉(zhuǎn)染后48 h分別提取細(xì)胞蛋白和RNA，采用Western blot和熒光定量PCR檢測SPC25的沉默效果。

1.8 MTS實(shí)驗(yàn) 分別將1×103個U87-siRNA-NC和U87-siRNA-SPC25細(xì)胞接種至96孔板中，每孔4個重復(fù)，連續(xù)接種五塊板，每日分別向其中1塊板中加入20 μL MTS試劑，3 h后采用紫外分光光度計(jì)檢測490 nm波長下吸光度值，分析其增殖率。

1.9 集落形成實(shí)驗(yàn) 分別向6孔板中接入500個U87-siRNA-NC和U87-siRNA-SPC25細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)14 d，采用1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗后觀察形成的集落數(shù)，集落形成率=(集落形成數(shù)/500) ×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，患者生存時間分析采用Kaplan-Meier分析，全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析 TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示， SPC25 mRNA在528例膠質(zhì)瘤組織中的平均表達(dá)水平(-0.23±0.41)高于10例正常腦組織(-1.72±0.45)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1A。進(jìn)一步采用Kaplan-Meier分析SPC25表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示SPC25高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者(50例)平均生存時間為13.6個月，SPC25低表達(dá)患者(40例)平均生存時間為14.8個月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)，見圖1B。

B

2.2 SPC25在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 90例膠質(zhì)瘤組織中SPC25蛋白和mRNA表達(dá)水平均高于10例對照腦組織，其表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤病理分級級別的升高依次增高，見封三圖1。SPC25高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者(50例)平均生存時間為22.4個月，SPC25低表達(dá)患者(40例)平均生存時間為29.5個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)，見封三圖2。

2.3 SPC25對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示，與U87-siRNA-NC細(xì)胞比較，U87-siRNA-SPC25細(xì)胞中SPC25蛋白呈低表達(dá)，見封三圖3。MTS結(jié)果顯示，U87-siRNA-SPC25細(xì)胞的吸光度值低于U87-siRNA-NC細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見封三圖4A。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87-siRNA-SPC25集落形成率低于U87-siRNA-NC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見封三圖4B。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，SPC25在肝癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中均存在異常的高表達(dá)現(xiàn)象，SPC25的過表達(dá)可促進(jìn)肝癌、前列腺癌、乳腺癌細(xì)胞的生長和侵襲[7-10]。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPC25過表達(dá)可導(dǎo)致小鼠生存時間顯著縮短，在前列腺癌細(xì)胞中沉默SPC25的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲活性顯著受到抑制，荷瘤裸鼠的生存時間顯著延長[10]。前列腺癌干細(xì)胞存在過高的SPC25表達(dá)，SPC25過表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系具有更為典型的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特征[10]。

本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)，TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，SPC25在膠質(zhì)瘤組織中的平均表達(dá)水平明顯高于正常腦組織，SPC25高表達(dá)膠質(zhì)瘤患者平均生存時間明顯低于低表達(dá)患者。同時，本研究分別采用Western blot、熒光定量PCR和免疫組化檢測90例膠質(zhì)瘤組織和10例對照腦組織中SPC25蛋白和mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤組織中SPC25表達(dá)水平明顯高于對照腦組織，SPC25高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者平均生存時間明顯低于低表達(dá)患者。本研究進(jìn)一步構(gòu)建siRNA，沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87中SPC25的表達(dá)，MTS和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，U87-siRNA-SPC25細(xì)胞的吸光度值和集落形成率均明顯低于U87-siRNA-NC細(xì)胞。

綜上所述，有絲分裂調(diào)控相關(guān)基因SPC25在膠質(zhì)瘤中存在高表達(dá)現(xiàn)象，可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后結(jié)局，SPC25可能為膠質(zhì)瘤治療研究的潛在靶點(diǎn)。