不同類型文冠果不同花期的揮發性物質及其釋放量的變化規律1)

胡楊 李鋼鐵 王倩玉 張玲 李珊珊 王亮生 烏志顏

(內蒙古農業大學，呼和浩特，010018) (中國科學研究院植物研究所北方資源植物重點實驗室) (赤峰市林業科學院)

花的揮發性成分是植物揮發性成分的重要組成部分，大自然中很多植物都會散發香味，而植物散發的這些香味的成分可以幫助植物傳播訊息和抑制雜草的生長，抵御病蟲害和細菌以免腐爛，還能吸引昆蟲來授粉[1]。植物花朵揮發性成分的釋放是隨著花朵的開放散發的，并且釋放量也會發生一定的變化。如西伯利亞百合(Lilium‘Siberia’)[2]、雙瓣茉莉(Jasminumsambac(L.) Aiton)[3]、鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl)[4]等植物花朵揮發性的散發在不同的花期會呈現出不一樣的變化規律，從總體上看均是半開期和盛開期的釋放量較高。由于花香在植物自我保護與觀賞品質提高等方面的重要作用，植物花香研究愈來愈受到人們重視，成為植物基礎研究的熱點之一。

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)別稱文官果、文登果、蒙文僧燈毛道，隸屬于無患子科(Sapindaceae)文冠果屬(Xanthoceras)，是一種落葉灌木或小喬木。文冠果是我國獨有，且生長在北方的珍貴的鄉土木本油料樹種，此樹種耐干旱、耐嚴寒、耐風沙、耐瘠薄。近年來，相關政府部門計劃在河北、內蒙、山西、遼寧、陜西、青海、甘肅、新疆、河南、吉林、黑龍江11省區規劃建設文冠果能源林[5]，隨著文冠果產業的發展以及國家政策的扶持，文冠果種植面積亦會不斷增加，因此，進一步開發文冠果的價值十分必要。由于文冠果繁花少實和落花落果現象嚴重，結實量不高，這種現象很大程度上影響了文冠果的開發利用[6]。但是，文冠果的花朵繁密，花期持續時間長達20 d，大面積種植可形成花海景觀，是優良景觀樹種；但具有芳香的樹種較少，所以開展文冠果花香性狀的研究，可為擴大文冠果的開發利用價值奠定理論基礎。

目前在百合(Liliumspp.)[7]、玫瑰(RosarugosaThunb)[8]、茉莉(Jasminumsambac(L.) Aiton)[9]、波葉金桂(Osmanthusfragrans‘Boyejingui’)[10]、小蒼蘭(Freesia)[11]、姜花(Hedychiumcoronarium)[12]等花卉中已有揮發性研究的報道，而文冠果的揮發性研究只在李斌等[13]調查篩選文冠果觀賞類型植株時提到過，帶香味的文冠果花期較早，靠近會有淡淡的香味散發出來，而剩余植株的花朵沒有明顯的香味，因為這種類型在文冠果中比較特殊，故單列為一種類型即有香型。此種類型較為罕見，僅在其調查的文冠果基地發現1株。張秀麗等[14]、段樹生等[15]均進行了觀賞文冠果的種質篩選，其中篩選到數株有香型文冠果，但并未對其揮發性物質進行研究。至今國內外還沒有文冠果揮發性成分分析的相關文獻報道，且文冠果育種關注點目前多在豐產方面，對于有香型文冠果品種選育還缺乏深入研究。筆者以兩個常見文冠果觀賞類型白花型和紅花型為對象，利用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)分析文冠果不同開花期揮發性成分的組成和釋放量的差異，揭示其花香成分組成及其釋放量在不同開放時期的變化規律，對文冠果花的鑒賞和闡明釋香機制具有理論參考價值，為文冠果的芳香型育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為具有代表性的兩種文冠果觀賞類型白花型(圖1)和紅花型(圖2)，其中分別選取了白花型無香一種(W-N-1)，有香兩種(W-Y-1、W-Y-2)；紅花型有香(R-Y-1)和無香(R-N-1)各一種。樣品采自山東沃奇農業開發有限公司及內蒙古文冠莊園農業科技開發有限公司的文冠果基地。于2019年4月在山東和2019年5月在赤峰的文冠果開花期間(文冠果花期一般可以持續20 d左右)，晴朗無風、光照良好的上午09:00—10:00分別采取4個不同花期的花朵，即每個品種在生長勢一致的3棵植株上分別采花苞期(開花前一天左右，部分小花頂端出現孔隙)、初開期(約10%花朵開放，大部分半閉合)、半開期(約50%花朵開放，小部分半閉合)、盛開期(70%以上的花朵開放，花被反卷)[16]的文冠果花樣品，采摘后立即返回實驗室進行揮發性成分測定。

圖1 文冠果白花型不同花期的形態特征

圖2 文冠果紅花型不同花期的形態特征

1.2 儀器

SPME手動固相微萃取進樣器和50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭為美國Supelco公司產品；氣相色譜-質譜聯用儀為美國Agilent公司產品，為7890B GC系統及7000C MS。

1.3 HS-SPME分析方法

先將DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭在氣相色譜的進樣口進行老化，老化溫度為250 ℃，老化時間1 h。然后將文冠果鮮花1 g樣品加入20 mL頂空進樣瓶中，同時加入10 μL 0.05 mg/mL的3-辛醇(3-octanol)作為內標，用鋁蓋加聚四氟乙烯硅膠隔墊密封。在恒溫水浴鍋中40 ℃恒溫30 min，然后將經過老化的DVB/CAR/PDMS纖維頭通過隔墊插入頂空瓶中，萃取頭固定于樣品上方1 cm處，頂空萃取20 min。然后立即將萃取頭插入GC進樣口，解吸3 min，進行GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析方法

色譜條件：HP-5MS彈性石英纖維毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣，流速為1 mL/min，分流比為2∶1，進樣口溫度250 ℃；程序升溫為初始溫度為55 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至210 ℃，保持1 min，后運行溫度為以210 ℃，保持2 min。

質譜條件：電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃。使用全掃描模式，且質荷比為45～600。

1.5 數據分析

揮發性組分經氣相色譜分離，不同組分形成其各自的色譜峰，用氣相色譜-質譜-計算機聯用儀進行分析鑒定。定性方法：對采集到未知化合物的質譜圖通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00檢索，并與圖譜庫(NIST14)的標準質譜圖進行對照分析，結合人工圖譜解析及資料分析，試驗僅取正反匹配度800～1 000的鑒定結果。定量方法：選擇3-辛醇為內標，其質量分數為40.9 ng/g，體積為10 μL，通過內標法進行定量分析。利用Excel軟件進行數據統計及制表，采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

經GC-MS分析，從白花型文冠果與紅花型文冠果這兩種觀賞類型中初步鑒定出42種花朵揮發性成分，可分為7大類，分別為萜烯類16種，主要為cis-β-可巴烯、δ-杜松烯；醇類9種，主要為芳樟醇和1-辛烯-3-醇；酯類7種，主要為2-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯和水楊酸乙酯；醛類5種，主要為苯甲醛，反式-2-己烯醛和壬醛；烷烴類3種，主要為正十三烷；此外還有1種酮類化合物為3-辛酮和1種含N類化合物為喹啉(表1、圖3)。

表1 不同類型文冠果不同開花期可檢測的揮發性成分及其釋放量 ng·g-1

續(表1) ng·g-1

注：表中數值為平均值±標準差；“-”表示未檢測到。

圖3 不同類型文冠果半開期揮發性成分總離子流圖

2.1 文冠果白花型和紅花型揮發性成分的比較

文冠果白花型和紅花型的揮發物總釋放量以W-Y-1最高(表2)，達到1 414.68 ng/g；W-Y-2和R-Y-1次之，分別為681.19和634.79 ng/g；W-N-1和R-N-1最低，分別為198.18和154.74 ng/g。對7大類花朵揮發物的釋放量進一步分析可以看出，白花型和紅花型兩個類型揮發性成分分別有43和15種，在4個時期共檢測到42種揮發性成分，共有成分僅4種，為反式-2-己烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和3-辛酮。對揮發性貢獻較大的化合物，紅花型和白花型兩種之間也有比較明顯的不同(表3)。紅花型不含有烷烴類、酯類和含N化合物，且萜烯類釋放量很少，白花型的揮發性成分主要由萜烯類、醇類和醛類貢獻，紅花型主要由醇類和醛類貢獻。醇類物質在各個文冠果品種中的數量相對來說較多，是文冠果花香中主要的揮發物，在不同接受測試的品種中其數量也存在較大差異。W-Y-2花的主要揮發性成分是萜烯類、醇類、酯類和醛類物質，是參試品種中感官上最香的一種，但其揮發性成分釋放量并非參試品種中最高的，推測是揮發性成分中微量成分與主要成分間協同作用結果。

表2 不同類型文冠果不同開花階段揮發性成分釋放總量

2.2 文冠果有香型和無香型揮發性成分的比較

白花型和紅花型文冠果中無香的為W-N-1和R-N-1，有香的為W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1。有香型和無香型分別檢測到揮發性成分分別有36和26種(表4)，有香型的主要揮發物類型多為醇類，無香型的揮發物類型種類雖多，但是釋放量都較少，且有香型的總釋放量比無香型的要高。有香型的主要揮發物質為芳樟醇，無香型的主要揮發物質為1-辛烯-3-醇和苯甲醛，并且W-N-1和R-N-1雖檢測到有醇類化合物，但是未檢測到芳樟醇，這是有香型文冠果和無香型文冠果最主要的區別。正十三烷和正十五烷為白花型有香的特有成分，β-波旁烯、大根香葉烯、3-蒈烯為W-Y-2的特有成分，(+)-β-柏木烯為R-N-1的特有成分，但是這些特有成分的共同特點是釋放量不高。有香型中W-Y-2較為特殊，其釋放量較高的物質如反式-2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、苯甲酸乙酯、水楊酸甲酯、水楊酸乙酯和喹啉均是在花苞期時釋放量最高，在其他時期明顯下降，總釋放量也是為花苞期最高。W-Y-1和R-Y-1中的醇類極其高，分別占其總釋放量的96.34%和96.69%，W-Y-2中也是醇類釋放量較高，為45.74%，其中芳樟醇為主效成分。芳樟醇釋放量在花朵的開放進程中釋放規律也不一樣(表3)，在W-Y-1和R-Y-1中從花苞期開始明顯呈上升趨勢，W-Y-2變化不太明顯。

表3 不同類型文冠果不同開花階段芳樟醇釋放量

2.3 文冠果白花型和紅花型開花過程中花香物質的變化

2.3.1 白花型文冠果揮發性成分及釋放規律

W-N-1花瓣不同發育時期所含的揮發性成分共25種。花苞期，W-N-1檢測到揮發性成分19種，釋放量達18.29%；初開期，檢測到揮發性成分17種，釋放量達18.31%；半開期，檢測到揮發性成分18種，釋放量達30.63%；盛開期，檢測到揮發性成分18種，釋放量達32.77%(表4)。可見，W-N-1揮發性成分總釋放量呈現自花苞期逐漸上升，初開期微升，至半開期升高，盛開期緩升的趨勢。W-N-1檢測到的6類揮發性成分中，萜烯類物質釋放量為最高，盛開期達到最高為54.47%，其中cis-β-可巴烯釋放量最高，次高為δ-杜松烯，在W-N-1開放進程中一直呈上升趨勢，苯乙烯為花苞期及此品種特有成分，不過釋放量很低為0.24%。醛類和醇類的釋放量均較高，反式-2-己烯醛和反-2-,順-6-壬二烯醛只在花苞時期出現，苯甲醛和壬醛在初開期開始出現，苯甲醛釋放量較高，醇類中只有1-辛烯-3-醇貫穿開放進程，在盛開期達到最高，此外，正辛醇為此時期所特有，但釋放量都不高。酯類、酮類和含N類物質釋放量不高，未檢測到烷烴類物質。W-N-1的主要揮發性成分為cis-β-可巴烯、δ-杜松烯、1-辛烯-3-醇和苯甲醛。

W-Y-1花瓣不同發育時期所含的揮發性成分共9種。花苞期，檢測到揮發性成分7種，釋放量達9.47%；初開期，檢測到揮發性成分3種，釋放量達27.87%；半開期，檢測到揮發性成分4種，釋放量達32.5%；盛開期，檢測到揮發性成分4種，釋放量為30.16%(表4)。可見，揮發性成分釋放量總體變化呈現花苞期最低—初開期微升—半開期最高—盛開期降低的變化規律。根據表1還可知，W-Y-1整個開放進程中檢測到的6類9種揮發性成分中，醇類釋放量最高，達96.34%；其中芳樟醇是釋放量最高的醇類，釋放量為93.72%。其它的5類物質中，萜烯類只在初開、半開和盛開(非花苞)時期檢測到一種揮發性成分3-蒈烯，且釋放量較低；醛類物質在初開期沒有檢測到物質，其他時期檢測到2種揮發性成分，釋放量不高，其中壬醛為半開盛開時期的特有成分；酯類、烷烴類和酮類物質只在花苞時期各檢測到1種物質，其釋放量很小或極低；含N類化合物未檢測到。綜上分析，W-Y-1的主要揮發性成分為芳樟醇。

W-Y-2花瓣不同發育時期所含的揮發性成分共32種。花苞期中有檢測到25種化合物，釋放量達31.84%；初開期，檢測到揮發性成分16種，釋放量達19.83%；半開期，檢測到揮發性成分18種，釋放量達20.62%；盛開期，檢測到揮發性成分20種，釋放量為27.71%(表4)。可見，揮發性成分釋放量在花苞時期最高，自初開期逐漸上升，至盛開期達到最高。W-Y-2整個開放進程中檢測到的7類33種揮發性成分中，醇類釋放量最高，為45.74%；其中芳樟醇是釋放量最高的醇類，釋放量為36.37%。萜烯類釋放量次高，為19.26%，大根香葉烯、β-波旁烯、δ-杜松烯和γ-依蘭油烯在4個時期中均可檢測到，并且釋放量呈持續增長的趨勢；大根香葉烯是釋放量最高的萜烯類，此揮發性成分為W-Y-2的特有成分，在非花苞時期檢測到3-蒈烯，且釋放量較低；花苞時期特有成分為β-依蘭烯，α-可巴烯、γ-杜松烯、1-表二環倍半水芹烯為盛開期特有成分，但是釋放量較低。酯類和醛類中大部分只在初開期出現，酯類中的水楊酸乙酯和醛類物質中苯甲醛和壬醛貫穿整個開放過程，但在芳香濃郁的盛開期水楊酸乙酯的釋放量為各時期最低，看來酯類不是主要揮發性成分。苯甲醛和壬醛釋放量呈持續上升的趨勢，且苯甲醛在盛開期較高。含N類化合物只檢測到喹啉，花苞時期的釋放量最高為13.37%，然后持續降低，盛開期未檢測到。烷烴類釋放量較低，且在盛開期釋放量反而降低。酮類物質釋放量極低。可得，W-Y-2的主要揮發性成分為芳樟醇、大根香葉烯和苯甲醛。

2.3.2 紅花型文冠果揮發性成分及釋放規律

R-N-1花瓣不同發育時期所含的揮發性成分共11種。花苞期，檢測到揮發性成分6種，釋放量達23.23%；初開期，檢測到揮發性成分5種，釋放量達13.33%；半開期，檢測到揮發性成分8種，釋放量達27.44%；盛開期，檢測到揮發性成分6種，釋放量為36%(表4)。此品種的揮發性成分釋放量規律為花苞時期較高，初開期降低然后半開期逐漸上升，至盛開期達到最高。R-N-1整個開放進程中檢測到的4類11種揮發性成分中，醇類釋放量最高，為39.72%；其中1-辛烯-3-醇是釋放量最高的醇類，釋放量為33.9%，3-己烯-1-醇只在花苞期檢測到，正辛醇和1-壬醇只在半開期檢測到，且釋放量較低。醛類釋放量次高，為19.15%；苯甲醛釋放量最高，且在4個時期中均可檢測到，釋放量呈持續增長的趨勢；反式-2-己烯醛雖可檢測到，但是釋放量持續降低；壬醛只能在半開期檢測到且釋放量不高。萜烯類中的(+)-β-柏木烯為R-N-1的特有成分，與cis-β-可巴烯只在盛開期出現且釋放量較低，苯乙烯反而在盛開期未檢測到。酮類中只檢測到3-辛酮，其釋放量呈持續上升的趨勢，且在盛開期達到最高。酯類、烷烴類和含N類化合物均為檢測到。可得，R-N-1的主要揮發性成分為1-辛烯-3-醇、苯甲醛。

R-Y-1花瓣不同發育時期所含的揮發性成分共8種。7種揮發性成分在花苞期被檢測到，釋放量達5.94%；初開期，檢測到揮發性成分5種，釋放量達26.86%；半開期檢測到揮發性成分4種，釋放量達35.49%；盛開期，檢測到揮發性成分5種，釋放量為31.07%(表4)。此品種揮發性成分釋放量呈現花苞期至半開期上升，然后盛開期降低的變化規律。根據表2可得，R-Y-1在4個時期共檢測到的3類9種揮發性成分中，醇類釋放量最高，釋放量高達96.69%；其中芳樟醇是釋放量最高的醇類，釋放量為85.45%；反式-2-己烯-1-醇為花苞時期特有成分，反式氧化芳樟醇釋放量呈增長的趨勢，但是這兩種揮發性成分都釋放量較低。醛類物質只在花苞期檢測到反式-2-己烯醛，盛開期檢測到壬醛。酮類物質只在花苞和初開時期檢測到1種物質，其釋放量很低。萜烯類、酯類、烷烴類和含N類化合物均未檢測到。通過分析可知，R-Y-1的主要揮發性成分為芳樟醇。

表4 文冠果揮發物的釋放量與成分種類數量

3 討論與結論

觀賞樹種的重要性狀之一就是花香，醇類和萜烯類化合物在許多植物的花香成分中占有很大比例，如在牡丹中發現α-蒎烯、香葉醇和香茅醇的釋放量最高[17]；在柑橘花中發現芳樟醇、檸檬烯和月桂烯為主要揮發性成分[18]；在大馬士革玫瑰中發現主要揮發物包括香茅醇，香葉醇[19]。本試驗分析了文冠果花瓣不同開放時期的揮發性成分，檢測到了42種揮發物，結果表明不同類型文冠果揮發性物質種類及釋放量都存在差異，整體上有香型文冠果揮發性成分主要以醇類、萜烯類和醛類為主，少量的烷烴類、酯類、酮類和含N類物質為輔。另外，不同生長地區的植物、植物花朵的開放狀態，采收季節等因素同樣會造成揮發性成分的不穩定性。本研究分析了白花型和紅花型文冠果花瓣的揮發性成分，其花香成分可分為萜烯類、醇類、醛類、酮類、酯類、烷烴類和含N化合物7大類，并且化合物數量及其釋放量隨花期表現出先增大后減小的規律，主要化合物基本在盛開期達到最大，其主要揮發性化合物類型為醇類、萜烯類和醛類，且在開放進程中均是醇類物質釋放量最高，其次為萜烯類和醛類，并鑒定出其主要揮發性物質包括芳樟醇、大根香葉烯、1-辛烯-3-醇和苯甲醛等。同時還發現白花型和紅花型所含揮發性成分差異較大，白花型含有本次檢測得到的7大類化合物，紅花型不含有7大類揮發性化合物中的酯類、烷烴類和含N類化合物，但是兩種花型在感官上都具有很好的香味，因此，揮發性成分的復雜性對于揮發性的貢獻還有待于深入研究。

花朵主要芳香揮發物質的釋放會隨著花瓣的開放而逐漸顯現出來[20]，本研究采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)結合氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)研究了白花型和紅花型文冠果4個發育時期揮發性成分與釋放量的變化，在4個時期檢測到的花香成分中醇類和萜烯類化合物是主要物質成分。隨著花朵的開放，酯類和含N類化合物成分的釋放量逐漸降低，萜烯類成分的釋放量逐漸增加，醇類和烷烴類成分的釋放量先增加后降低，醛類和酮類成分的釋放量先降低后增加，且主要揮發性組成成分的釋放量均在半開期最高。從文冠果的花香成分分析發現無香型文冠果花W-N-1和R-N-1中沒有檢測到芳樟醇，有香型文冠果W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1這3個以醇類為主的參試品種普遍在感官上有明顯的花香，這與其中大量存在芳樟醇有關，且W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1花中芳樟醇釋放量分別占總釋放量的93.72%、36.37%和85.49%，可初步確定芳樟醇為文冠果花朵釋香的關鍵成分。文冠果花瓣揮發性成分檢出的芳樟醇這一主要成分，不僅釋放量高，而且具有應用價值。芳樟醇是一種用途廣，用量大的香料品種，是香水香精等日化產品中使用頻率最高的單方香料，它的主香是鈴蘭花型揮發性，常用與合成其他芳樟酯類香料，需求量很大[21]。發現W-Y-1和R-Y-1含有芳樟醇類活性物質釋放量占總釋放量的80%以上，可以進一步研究作為芳樟醇類物質產業開發的品種。

由氣相色譜-質譜聯用的分析結果可知，從白花型文冠果與紅花型文冠果這兩種觀賞類型中鑒定出萜烯類、醇類、酯類、醛類、烷烴類、酮類和含N類化合物共7類42種花朵揮發性化合物。在不同類型文冠果不同花期的揮發性組分及其釋放量的差異較大，白花型文冠果的揮發性成分組成比紅花型文冠果的豐富，有香型文冠果(W-Y-1、W-Y-2和R-Y-1)和無香型文冠果(W-N-1和R-N-1)最主要的成分區別在于有香型文冠果中含有芳樟醇，而無香型文冠果中不含有芳樟醇。總體上醇類和萜烯類成分是文冠果花釋香的關鍵成分，主體成分是芳樟醇，且主要揮發性成分的釋放量均在半開期最高。通過對文冠果不同花期花瓣的揮發性成分開展測定分析，掌握文冠果花香成分組成和釋放量的差異變化，對文冠果花的鑒賞和芳香型育種提供理論參考。