禽飼料中5種聚醚類抗球蟲藥物檢測(cè)方法研究

楊 露，譚會(huì)澤，劉松柏，陳 丹，余軍軍

(溫氏食品集團(tuán)股份有限公司//農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 云浮 527400)

球蟲病是由寄生于宿主腸道或膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的艾美耳科原蟲引起的家禽常見(jiàn)且危害嚴(yán)重的寄生蟲病。球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失是巨大的，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)雞球蟲病的防治主要是依靠聚醚類抗球蟲藥物，如甲基鹽霉素(NAR)、鹽霉素(SAL)、莫能菌素(MON)、拉沙洛西鈉(LAS)、馬杜霉素(MAD)等。這些聚醚類藥物是20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的一類離子載體抗生素，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上非常相似，大多都含有一個(gè)一元有機(jī)酸和許多醚基，因而可形成多種金屬鹽。聚醚類抗球蟲藥經(jīng)常以鈉鹽、鉀鹽或銨鹽的形式存在，微溶或不溶于水，易溶于低級(jí)醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、四氯化碳及正己烷等，且在中性或堿性環(huán)境中穩(wěn)定。它們能與球蟲細(xì)胞中的陽(yáng)離子緊密結(jié)合，改變細(xì)胞膜上脂質(zhì)屏障的滲透性，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，導(dǎo)致大量水分進(jìn)入球蟲細(xì)胞，最終使球蟲腫脹死亡[1]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于莫能菌素、鹽霉素、甲基鹽霉素、拉沙洛西鈉和馬杜霉素的檢測(cè)方法，主要為微生物法、免疫學(xué)分析法、光譜法、色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法等[2]。本研究是利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法摸索測(cè)定飼料中5種聚醚類抗球蟲藥的檢測(cè)方法，優(yōu)化目前已有的液相色譜條件和化合物質(zhì)譜條件，使其靈敏度更高、重現(xiàn)性更好，結(jié)果更加準(zhǔn)確，能更好的滿足禽用飼料中聚醚類抗球蟲藥物的檢測(cè)。

1 方法原理

試料中的聚醚類抗球蟲藥物經(jīng)乙腈提取，然后硅膠固相萃取柱凈化后，備用液用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。

2 材料與方法

2.1 試劑

甲醇、乙腈、甲酸試劑，色譜純；正己烷-乙醚(50+50)；二氯甲烷-甲醇(90+10)；聚醚類抗球蟲藥標(biāo)準(zhǔn)溶液等。

2.2 儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有電噴霧電離源ESI)，渦動(dòng)儀；離心機(jī)，分析天平，硅膠固相萃取柱(500 mg/(6 ml))，水浴氮吹儀，0.22 μm有機(jī)濾膜。

2.3 儀器條件

2.3.1液相色譜條件

液相色譜條件見(jiàn)表1。

表1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18柱，100 mm×2.1 μm(i.d.)，粒徑1.7 μm。柱溫：50℃。

流動(dòng)相：甲醇(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸(97+3)。流速：0.3 ml/min。進(jìn)樣體積：10 μl。

2.3.2質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 聚醚類藥物測(cè)定的質(zhì)譜條件

掃描方式：正離子掃描。

檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)。

電噴霧毛細(xì)管電壓：2.8 kV。

取樣錐孔電壓：1.0 V。

透鏡電壓：0.5 V。

離子源溫度：80℃。

去溶劑溫度：300℃。

倍增器電壓：650 V。

二級(jí)碰撞氣：氬氣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

2.4.1標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源

鹽霉素、拉沙洛西鈉、莫能菌素、甲基鹽霉素和馬杜霉素(純度均≥95%)由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供。

2.4.2不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液

單個(gè)聚醚類標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 μg/ml)：分別準(zhǔn)確稱取鹽霉素、拉沙洛西鈉、莫能菌素、甲基鹽霉素和馬杜霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇分別溶解并定容10 ml容量瓶中，制成1 000 μg/ml的單個(gè)聚醚類抗球蟲藥標(biāo)準(zhǔn)液。-20℃保存，有效期為12個(gè)月。

5種聚醚類混合標(biāo)準(zhǔn)液(100 μg/ml)：分別準(zhǔn)確量取適量5種1 000 μg/ml單個(gè)聚醚類標(biāo)準(zhǔn)溶液于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)液。-20℃保存，有效期6個(gè)月。

5種聚醚類混合標(biāo)準(zhǔn)液(10 μg/ml)：準(zhǔn)確量取適量100 μg/ml聚醚類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，用甲醇稀釋成10 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)液。-20℃保存，有效期6個(gè)月。

5種聚醚類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：量取適量10 μg/ml聚醚類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇(含0.1%甲酸)依次稀釋成濃度為1、2、10、20、100、200 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 樣品前處理

2.5.1提取

稱取試樣2 g(精確到0.01 g)于50 ml離心管中，加20 ml乙腈，振蕩提取30 min，2 000 r/min 4℃條件下離心5 min，取上清液至離心管。殘?jiān)?0 ml乙腈重復(fù)提取一次，合并2次上清液。將提取液于雞心瓶，40℃旋蒸至干，用3 ml正己烷溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至10 ml離心管。再用2 ml正己烷洗滌雞心瓶，合并2次溶解液，3 500 r/min離心5 min，上清液備用。

2.5.2凈化

取硅膠固相萃取柱，加5 ml正己烷預(yù)洗，將上述得到的上清液過(guò)萃取柱，加乙醚-正己烷(50/50)8 ml洗滌，抽干，加二氯甲烷-甲醇(90/10)6 ml洗脫，收集洗脫液，40℃下氮?dú)獯蹈桑状?含0.1%甲酸)1.0 ml溶解殘?jiān)^(guò)0.22 μm濾膜后上液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析[3]。

2.5.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇(含0.1%甲酸)溶液稀釋成1.0、2.0、10.0、20.0、100、200 ng/ml的工作溶液。將5個(gè)飼料空白樣品按樣品提取凈化步驟處理，氮?dú)獯蹈珊螅蒙鲜鰳?biāo)準(zhǔn)工作液溶解后上機(jī)測(cè)定，將各抗球蟲藥物定量離子峰面積與其響應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的工作曲線以及各組織中的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，詳情見(jiàn)表3。

2.5.4回收率

在禽用配合飼料空白樣品中分別添加25、125 ng/ml兩種不同濃度的聚醚類抗球蟲藥進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)濃度5個(gè)平行，連續(xù)做3 d，分別求得回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 結(jié)果與分析

3.1 基質(zhì)匹配加標(biāo)校準(zhǔn)曲線

從檢測(cè)結(jié)果看，5種聚醚類抗球蟲藥的線性條件都較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。這證明5種聚醚類抗球蟲藥物在濃度1～200 ng/ml的范圍內(nèi)呈線性相關(guān)關(guān)系。

3.2 添加回收率測(cè)定

在禽用配合飼料空白樣品中分別添加25、125 ng/ml兩種不同濃度的聚醚類抗球蟲藥進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 5種聚醚類藥物的添加回收率試驗(yàn)結(jié)果

從檢測(cè)結(jié)果看，5種聚醚類抗球蟲藥檢測(cè)的日內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，日間變異系數(shù)也均小于10%。對(duì)于藥物測(cè)定的方法回收率偏差范圍，據(jù)GB/T 27404—2008的附錄F.1中要求，新建立的方法回收率在要求范圍內(nèi)。而且按照農(nóng)業(yè)部1862號(hào)公告:4—2012《飼料中5種聚醚類藥物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中要求：在重復(fù)條件下完成的2個(gè)平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差不大于15%，檢測(cè)結(jié)果表明該方法滿足條件。

4 結(jié)論

利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)快速、定性定量準(zhǔn)確、回收率較高，解決了長(zhǎng)期以來(lái)禽用飼料中聚醚類藥物殘留檢測(cè)中常常遇到的雜質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)等問(wèn)題，完全滿足對(duì)建立禽用飼料中5種聚醚類藥物殘留檢測(cè)方法的要求。