玉郎傘查爾酮對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌缺血的保護(hù)作用

覃斐章 秦秋華 禤霏霏 黃媛恒 李映新 董敏

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2南寧市第二人民醫(yī)院)

心肌缺血是冠狀動(dòng)脈痙攣、栓塞、高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等疾病的共同病理基礎(chǔ)。

發(fā)病機(jī)制涉及活性氧增多、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、能量代謝異常等，其中炎癥反應(yīng)發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。研究表明，心肌 NOD 樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體是引起無菌性炎癥的重要介質(zhì)〔1〕。NLRP3炎癥小體可以促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18的分泌，并和腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子共同作用，參與早期的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生與擴(kuò)大〔2〕。另外，NLRP3炎癥小體的激活，還可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，加重心肌損傷〔3〕。玉郎傘系豆科植物疏葉崖豆的干燥根，是廣西壯、瑤族常用藥材，具有調(diào)節(jié)血糖、降低血壓、治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)腫痛、腦卒中偏癱等功效。玉郎傘查爾酮(YLSC)是玉郎傘中主要活性成分，具有抗氧化、抗凋亡等作用，還能通過核因子(NF)-κB信號(hào)通路減輕缺血再灌注大鼠的炎癥反應(yīng)〔4〕。然而YLSC的心肌保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察YLSC對(duì)異丙腎上腺素所致心肌缺血的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響，探討NLRP3炎癥小體在其中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只雄性SPF級(jí)KM小鼠，18～22 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)：SYXK(桂) 20140003。實(shí)驗(yàn)期間小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，室溫保持18～25℃，自由飲水。

1.2試劑 YLSC(由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供，HPLC顯示其純度為98%)；鹽酸異丙腎上腺素注射液購自上海禾豐制藥有限公司；鹽酸普萘洛爾注射液購自華潤紫竹藥業(yè)有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；RIPA裂解液、PMSF購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；麗春紅S 生物染色劑購自北京索萊寶科技有限公司；Western印跡一抗NLRP3、凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1、GAPDH購自美國Santa Cruz 公司；Western印跡二抗購自北京中杉金橋公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒、心肌肌鈣蛋白(cTn)T、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器 HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；722S型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；奧林巴斯光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；伯樂電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及建模 將小鼠分為正常組、模型組、普萘洛爾組(1 mg/kg)、YLSC低劑量組(3 mg/kg)、中劑量組(6 mg/kg)、高劑量組(12 mg/kg)。正常組和模型組給予等體積生理鹽水，各組均按10 ml/kg尾靜脈注射給藥，連續(xù)15 d。模型的建立參考文獻(xiàn)〔5〕。除正常組外其余各組于第16天、第17天、第18天，腹腔注射異丙腎上腺素10 mg/kg，每天1次，連續(xù)注射3 d制備小鼠心肌缺血模型。

1.5血清心肌酶CK-MB、cTnT檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，拔眼球取血，室溫凝聚1 h 后3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒說明書測(cè)定血清CK-MB、cTnT含量。

1.6心肌組織SOD、MDA、CAT、GSH-Px測(cè)定 取左心室組織，生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重。加入體積是組織塊重量9倍冰凍生理鹽水，在冰水浴條件下用組織勻漿器制成10%組織勻漿。5 000 r/min，4℃離心15 min，取上清，按試劑盒說明書檢測(cè)心肌SOD、MDA、CAT、GSH-Px含量。

1.7心肌組織病理學(xué)觀察 取心尖部組織，冰凍生理鹽水沖洗干凈，4%多聚甲醛溶液固定24～72 h。取固定好的心肌組織，常規(guī)石蠟包埋，切片。切片入Harris蘇木素中3～8 min染細(xì)胞核，氨水返藍(lán)，再入伊紅染液中1～3 min染細(xì)胞質(zhì)，流水洗凈。切片依次用95%酒精、無水乙醇、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理學(xué)變化。

1.8血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18的測(cè)定 血清1 000 r/min離心20 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量。

1.9心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的測(cè)定 稱取50 mg心肌組織，用組織剪將其盡量剪碎，加入1 ml RIPA裂解液及10 μl PMSF混勻，冰水浴條件下勻漿機(jī)勻漿，每次10 s，重復(fù)2～3次。將組織勻漿置于離心管中，4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩６姿?BCA)法測(cè)定蛋白含量。取50 μg蛋白上樣量，12%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，恒定電壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。隨后加入相應(yīng)一抗(NLRP3 1∶400，ASC 1∶200，Caspase-1 1∶500，GAPDH 1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入二抗37℃孵育2 h，ECL發(fā)光，X線片顯影、定影。將膠片拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1YLSC對(duì)心肌酶CK-MB、cTnT含量的影響 與正常組比較，模型組血清心肌酶CK-MB、cTnT含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，普萘洛爾組和YLSC中、高劑量組能明顯降低血清cTnT含量(P<0.01)，普萘洛爾組和YLSC各劑量組均能明顯降低血清CK-MB含量(P<0.01)。見表1。

表1 YLSC對(duì)血清CK-MB、cTnT含量的影響

2.2YLSC對(duì)心肌SOD、MDA、CAT、GSH-Px含量的影響 與正常組相比，模型組心肌MDA含量明顯升高(P<0.01)，CAT、SOD、GSH-Px含量明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，普萘洛爾組和YLSC低、中、高劑量組能明顯降低MDA含量，明顯升高CAT、SOD、GSH-Px含量(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 YLSC對(duì)心肌SOD、MDA、CAT、GSH-Px含量的影響

2.3YLSC對(duì)心肌病理結(jié)構(gòu)的影響 正常組心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，核明顯，肌纖維無水腫，無炎細(xì)胞浸潤。模型組心肌纖維部分溶解、斷裂，心肌纖維水腫嚴(yán)重，有大量炎細(xì)胞浸潤，少量紅細(xì)胞滲出。普萘洛爾和YLSC低、中、高劑量組病變不同程度減輕，心肌纖維水腫明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

2.4YLSC對(duì)血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量的影響 與正常組比較，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，普萘洛爾和不同劑量YLSC預(yù)處理后，血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3。

圖1 YLSC對(duì)心肌病理結(jié)構(gòu)的影響(HE，×400)

表3 YLSC對(duì)血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18水平及對(duì)心肌NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5YLSC對(duì)心肌NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)量的影響 與正常組比較，模型組心肌NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)量明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，普萘洛爾和YLSC低、中、高劑量組心肌NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表3、圖2。

1～6：正常組、模型組、普萘洛爾組、YLSC低、中、高劑量組圖2 YLSC對(duì)心肌NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

心血管疾病是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病，但其發(fā)病機(jī)制并未完全清楚。異丙腎上腺素屬于β受體激動(dòng)藥，能通過加快心率和心肌收縮力，增加耗氧量等機(jī)制引起心肌損傷。給予不同劑量和時(shí)間的異丙腎上腺素，能引起嚴(yán)重程度不一的心肌損害，如可誘發(fā)藥物性心肌缺血、心肌梗死、心肌肥厚和心律失常等〔6〕。

心肌受損時(shí)，心肌酶釋放入血，血清心肌酶的含量能反映和監(jiān)測(cè)心肌的病理變化。cTnT具有高度的敏感性和特異性，心肌損傷4～6 h可檢測(cè)出，18～36 h達(dá)高峰，有助于早期識(shí)別心功能障礙〔7〕。CK-MB 是一種心肌特異性的同工酶，在心肌中含量最高，CK-MB升高程度與病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示YLSC能維持細(xì)胞膜的完整性，減少心肌酶的漏出。

氧化應(yīng)激水平的升高是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死的重要機(jī)制之一。心肌缺血的患者可以觀察到氧化和抗氧化系統(tǒng)的失衡。MDA是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)，誘導(dǎo)突變和減少酶的活性。SOD、CAT、GSH-Px是體內(nèi)抗氧化損傷的重要防御酶，能有效地清除自由基。本研究結(jié)果提示YLSC能增加抗氧化酶活性，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起的氧化應(yīng)激損傷。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3、ASC、Caspase-1組成的多蛋白復(fù)合物，在調(diào)節(jié)固有免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。NLRP3與ASC結(jié)合后，激活Caspase-1，進(jìn)而剪切IL-1β、IL-18前體，使之成為成熟的具有分泌活性的IL-1β和IL-18〔8〕。IL-1β、IL-18誘發(fā)炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為后續(xù)的巨噬細(xì)胞的聚集、激活，繼而誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子、趨化因子及黏附分子等的合成，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步被放大〔9〕。血清IL-1β和TNF-α的增加，還參與了急性心肌梗死后膠原和瘢痕的形成〔10〕，引起心肌纖維化〔11〕，激活了心肌重構(gòu)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者外周血單核細(xì)胞中NLRP3炎癥小體被激活，同時(shí)血清L-1β、IL-18表達(dá)增多〔12〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠離體心臟缺血/再灌注后心肌酶滲出增多，炎癥因子表達(dá)增加，機(jī)制與NLRP3炎癥小體活性增加有關(guān)〔13〕。Toldo等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，再灌注1 h內(nèi)使用NLRP3抑制劑能明顯縮小心肌梗死面積。腹腔注射NLRP3抑制劑VX-765后，能夠抑制急性心肌梗死大鼠NLRP3炎癥小體過度活化，改善心功能，提高線粒體膜電位及ATP合成活力〔15〕。敲除NLRP3炎性小體相關(guān)基因可預(yù)防高血壓、冠心病、心肌炎、 心律失常等心血管疾病，并可減緩與年齡相關(guān)的心功能退化〔16〕。因此，NLRP3拮抗劑有望用于心血管疾病的治療。本研究結(jié)果提示YLSC的心肌保護(hù)作用可能與抑制炎癥因子的產(chǎn)生和NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)。