外源性趨化因子CXC配體1促進肝癌細胞惡性行為的作用機制

秦梓棋 程瑤 翁金如 湖連濤 李玥 王偉群

(佳木斯大學 1檢驗醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；2口腔醫學院；3基礎醫學院)

肝癌包括肝細胞癌(HCC)、肝內膽管癌(ICC)和其他罕見腫瘤，其中最主要的是纖維狀層狀癌和肝母細胞瘤〔1,2〕。研究顯示，2018年肝癌的新發病例為841 000例，病死高達782 000例〔3〕。流行病學研究表明，肝癌發生有明顯地域差異，北歐和北美地區發病率較低，而亞太地區則高發〔4〕。中國已經成為肝癌的重災區，有超過50%肝癌患者來自于中國〔5〕。目前認為，許多危險因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、酒精攝入、肝病史和吸煙等已被證實與肝癌發生率升高具有顯著相關性〔6〕。據統計，在病毒相關性肝癌中，75%～80%的肝癌發生與HBV感染有關，10%～20%與HCV感染有關，這表明炎癥反應和免疫應答在肝癌發生與發展過程中具有重要作用〔7〕。

趨化因子是由細胞分泌的一類蛋白信號分子，因其具有誘導反應細胞做定向移動和趨化的能力，故名趨化因子。根據位于氨基端兩個保守半胱氨酸殘基的排列方式不同，趨化因子可分為CXC、CC、C和 CX3C四個亞家族〔8〕。在CXC亞家族中，又根據功能區第一個半胱氨酸前是否存在谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)氨基酸結構，把其分為ELR+CXC和ELR-CXC〔9〕。趨化因子的功能實施主要是由G蛋白耦聯7次跨膜趨化因子受體介導的，趨化因子與其受體間存在復雜的對應關系，1個受體可以結合多個配體，如CXCR1可結合CXCL6和CXCL8；反之，1個配體也可有多個受體，如CXCL6的受體有CXCR1和CXCR2，這種混亂的對應關系構成了趨化因子間復雜的細胞網絡系統〔10〕。此外，趨化因子也可結合非G蛋白耦聯7次跨膜受體的非典型趨化因子受體(ACKR)，該受體雖然不能介導常規趨化因子受體的信號通路，但可經清除趨化因子而調控趨化因子在組織中的濃度。迄今為止，人們已識別出近50種趨化因子，它們可分別經20種G蛋白耦聯趨化因子受體和4種ACKR發揮生物學功能〔11〕。

趨化因子的主要生理功能是在炎癥及免疫應答中調控和誘導多種粒細胞的激活、趨化及遷移。此外，趨化因子還被認為在淋巴組織的發育、免疫細胞的成熟及適應性免疫應答的產生和傳遞過程中發揮重要作用。趨化因子及其受體的表達失調可涉及許多人類疾病，其中包括自身免疫性疾病、炎癥性疾病和惡性腫瘤〔11〕。炎性細胞浸潤幾乎是所有惡性腫瘤的基本特征之一，而趨化因子在引導炎性細胞向腫瘤微環境內積累起著關鍵作用。慢性炎癥易導致腫瘤的形成和發展，原因之一是由趨化因子吸引來的炎性細胞，在腫瘤微環境中可提供促進腫瘤發展的生長因子和血管生成因子〔12〕。但越來越多的證據也表明趨化因子對表達趨化因子受體的腫瘤細胞具有直接作用。腫瘤微環境中的腫瘤細胞、間質細胞及趨化來的炎性細胞等均可釋放多種趨化因子，細胞間可經自分泌和旁分泌途徑影響腫瘤細胞的增殖、分化、遷移、侵襲并誘導腫瘤微環境中的血管發生〔12〕。本研究探討外源性CXCL1對肝癌細胞惡性行為的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞、材料及儀器RPMI1640 培養基、胎牛血清(FBS)和Transwell小室(美國Corning公司)，BEL-7402肝癌細胞(美國模式菌種收集中心)，重組人CXCL1(美國PeproTech公司)，兔抗BCL-2多克隆抗體(中國Affinity公司)，鼠抗AKT單克隆抗體和鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(中國Abways公司)，細胞計數試劑(CCK)-8和二辛喹酸(BCA)蛋白定量試劑盒(中國武漢博士德生物公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，細胞培養瓶、培養板(美國Corning公司)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Milipore公司)，辣根過氧化物酶(HRP)耦聯二抗(中國北京中杉金橋公司)，增強化學發光(ECL)試劑(美國Thermo公司)，放射性免疫沉淀法分析(RIPA)蛋白裂解液(上海碧云天生物公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(北京索萊寶公司)，圖像采集及分析系統、EPS300電泳儀、蛋白電泳槽和轉膜槽(上海天能公司)，全自動多功能酶標儀(美國BIO-TEK公司)，倒置光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，高速冷凍離心機(德國Beckman公司)。

1.2細胞增殖實驗 將BEL-7402肝癌細胞按2×103個/孔接種到96孔板各孔中；將孔板中的細胞分為3組，每組10孔，各組所用的培養基分別為含0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1和10%FBS的RPMI1640完全培養基；將細胞置于含5%CO2的37℃培養箱中培養72 h；向各孔中分別吸入10 μl CCK-8試劑，然后在含5%CO2的37℃培養箱中繼續培養2 h；將孔板置于酶標儀中讀取450 nm波長的光密度值。

1.3細胞遷移實驗 將BEL-7402肝癌細胞按1×104個/孔接種到Transwell上室各孔中；將孔板中的細胞分為3組，每組4室；各組上室中的培養基分別為含0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1的無血清RPMI1640培養基，而下室均為含10%FBS的RPMI1640完全培養基；將細胞置于含5%CO2的37℃培養箱中培養24 h；用脫脂棉簽擦拭小室上表面以去除未遷移細胞；利用甲醇結晶紫染色后，自來水沖洗、晾干，在倒置微鏡下拍照并計算遷移細胞數。

1.4Western印跡實驗 將BEL-7402肝癌細胞按1×106個/孔接種到6孔板各孔中；將孔板中的細胞分為3組，各組所用的培養基分別為含0、5、10 ng/ml外源性CXCL1和10%FBS的RPMI1640完全培養基；將細胞置于含5%CO2的37℃培養箱中培養72 h；胰蛋白酶消化細胞后將細胞懸液轉移至離心管中；低速離心機中離心5 min(800 r/min)以收集細胞沉淀；向細胞沉淀中加入200 μl RIPA蛋白裂解液和2 μl PMSF，劇烈吹打以保證細胞完全裂解；將離心管置于4℃高速冷凍離心機中離心20 min(15 000 r/min)；將上層液體移入新的離心管中，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；吸取40 μg總蛋白在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳；將蛋白轉移到PVDF膜上；用5%脫脂奶對膜封閉60 min；磷酸緩沖液-吐溫(PBS-T)洗滌3次×5 min，將膜在4℃冰箱中分別用Bcl-2(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗孵育過夜；PBS-T洗滌3次×5 min，將膜在37℃中用HRP耦聯二抗(1∶10 000)孵育30 min；PBS-T洗滌4次×8 min；將膜用ECL試劑孵育并置于凝膠成像系統中顯影和拍照。

1.5統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1外源性CXCL1促進BEL-7402肝癌細胞增殖 細胞培養72 h后，CCK-8增殖實驗顯示，0、5和10 ng/ml 外源性CXCL1處理組的光密度值分別為(0.71±0.11)、(0.82±0.12)、(1.24±0.36)。與0 ng/ml處理組比較，5、10 ng/ml處理組顯著增高(P=0.000 4；P=0.000 0)，說明外源性CXCL1可顯著促進BEL-7402肝癌細胞的增殖能力。

2.2外源性CXCL1促進BEL-7402肝癌細胞遷移 細胞培養24 h后，Transwell遷移實驗顯示，0、5、10 ng/ml 外源性CXCL1處理組的細胞遷移數分別為(104.75±15.92)個、(111.50±6.86)個、(248.00±53.17)個。與0 ng/ml處理組比較，10 ng/ml處理組顯著增高(P=0.002 1)，說明外源性CXCL1可顯著促進BEL-7402肝癌細胞的遷移能力。

2.3外源性CXCL1上調BEL-7402肝癌細胞Bcl-2和AKT蛋白表達 0、10 ng/ml 外源性CXCL1處理組細胞的Bcl-2相對表達量分別是(0.32±0.11)和(1.35±0.21)，兩者差異顯著(P=0.001 5)；0、10 ng/ml 外源性CXCL1處理組細胞的AKT相對表達量分別是(0.94±0.11)和(2.89±0.40)，兩者差異顯著(P=0.001 2)。見圖1。

圖1 外源性CXCL1上調BEL-7402肝癌細胞Bcl-2和AKT蛋白表達

3 討 論

趨化因子是一類分子量為8～12 kD的細胞因子超家族成員，具有廣泛的生物學作用，在免疫細胞和骨髓造血細胞的生成、分化、發育及免疫應答的調控等過程中發揮重要作用，還參與炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病的病理生理過程〔13〕。

目前認為，趨化因子可經多條信號轉導通路調控腫瘤細胞增殖及存活。如趨化因子可通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路，調控生長相關基因如細胞周期蛋白(cyclin)D1〔14〕、即刻早期反應因子(Egr)-1〔15〕、原癌基因(Fos)〔16〕、肝素結合性表皮生長因子(HB-EGF)〔17〕基因的表達而促進腫瘤細胞增殖。此外，趨化因子也可通過影響凋亡相關基因的表達來打破凋亡/抗凋亡之間的平衡，從而實現其促增殖活性，如上調p53結合蛋白同源物(Mdm2)〔18〕和Bcl-2〔19〕基因的表達，下調半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-7和腫瘤壞死因子受體超家族成員(TNFRSF)10C基因的表達〔20〕。所有實體腫瘤都需要血管系統來提供營養，如果沒有新生血管的形成，腫瘤在缺少血供的情況下既不能迅速增大，也不能向遠處轉移。在趨化因子家族中，CXC類趨化因子對血管具有重要的調控作用，它們可經MAPK/ERK、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT和Wnt/β-連環蛋白(Catenin)等多條信號轉導途徑影響腫瘤的血管生成〔21,22〕。通常情況下，ELR+CXC 類趨化因子(如CXCL1、CXCL3、CXCL5和CXCL8等)可通過表達于內皮細胞上的CXCR2受體促進內皮細胞的增殖，進而導致血管生成。而ELR-CXC類趨化因子(如CXCL4、CXCL9和CXCL10等)則可經抑制內皮細胞的趨向性而抑制血管生成〔23〕。趨化因子及其受體在腫瘤細胞侵襲、轉移中亦發揮關鍵的調控作用，如Itatani等〔24〕發現在結直腸癌中多種趨化因子/受體軸如CXCL1/CXCR2、CXCL9/10/CXCR3、CXCL12/CXCR4、CCL2/CCR2、CCL5/CCR5和CCL15/CCR1等均可參與腫瘤細胞的侵襲和轉移活性。

CXCL1又名GRO-α，屬于ELR+CXC類趨化因子，其主要通過與其細胞膜上特異性受體CXCR2結合而發揮生物學作用。研究表明，CXCL1在許多人類腫瘤中表達上調，并且其表達上調與腫瘤的高臨床分期、分級、遠處轉移和總體生存期具有顯著相關性〔25〕。功能研究顯示，腫瘤細胞分泌的高水平CXCL1可引導腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和腫瘤相關成纖維細胞(CAF)趨化至腫瘤微環境中，而來源于腫瘤細胞、TAM和CAF的CXCL1可經自分泌的旁分泌途徑促進腫瘤的增殖活性〔26〕。Payne等〔27〕報道CXCL1、CXCL2和CXCL3等趨化因子對黑色素瘤細胞的生長有直接促進作用，在體外應用特異性抗體阻斷CXCL1 或其受體CXCR2，黑色素瘤細胞生長受到抑制。

Yang等〔28〕研究表明，肝癌細胞表達趨化因子CXCL5及其受體CXCR2，當外源性給予或過表達CXCL5可經旁分泌及自分泌途徑促進肝癌細胞的增殖及遷移能力。既然CXCL1與CXCL5共享同一受體CXCR2，提示CXCR2介導的信號通路參與肝癌的發生與發展進程，可能部分是通過其另一配體CXCL1發揮作用的。本文結果表明，不同濃度的外源性CXCL1可分別促進BEL-7402肝癌細胞的增殖和遷移能力。進一步機制研究表明，外源性CXCL1還可上調BEL-7402肝癌細胞Bcl-2和AKT蛋白的表達。作為一種重要的凋亡相關基因，Bcl-2可通過抑制細胞凋亡途徑，來促進細胞存活和細胞分裂，因此在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用〔29〕。PI3K/AKT是細胞內重要的信號轉導通路，在多種人類腫瘤中，該通路的異常激活可參與和調控腫瘤細胞的增殖、遷移及代謝等過程〔30〕。研究表明AKT 亦可抑制腫瘤細胞凋亡，這與其磷酸化下游凋亡相關分子如 Bcl-2、caspase家族成員有關〔30〕。

綜上，外源性CXCL1可經活化Bcl-2/AKT抗凋亡途徑促進肝癌細胞的惡性進程。