染料木素在實驗性狼瘡性腎炎中的作用及機制

舒嶠 方衛東 任稱發

(贛州市人民醫院腎內科，江西 贛州 341000)

狼瘡性腎炎(LN)是以補體大量激活，免疫復合物在腎小球內沉積，腎小球增生和硬化，腎組織炎癥反應為特點的系統性紅斑狼瘡(SLE)所導致的腎損害〔1〕。LN是導致SLE患者終末期腎臟病的首要原因，盡管激素及免疫抑制劑能夠改善部分LN患者預后，但仍有大量的LN患者進展為終末期腎病〔2〕，極大增加了患者的經濟負擔，影響患者生活質量。現有研究表明免疫調節失衡是LN發生發展的重要環節，腎內炎性細胞和炎性因子的大量浸潤導致不可逆腎損害是LN的主要原因。因此，尋找調節自身免疫功能潛在方法，通過抑制炎癥反應對于開發LN治療藥物至關重要。染料木素作為一種大豆異黃酮類植物雌激素，在腫瘤、糖尿病、心血管疾病中均能發揮作用，其中抗炎作用最為突出〔3〕。有研究顯示，染料木素通過調節炎癥介質來改善環磷酰胺誘導的肝毒性〔4〕。Abron等〔5〕發現染料木素能夠誘導巨噬細胞極化及調控全身炎癥因子，從而改善結腸炎。染料木素通過抑制巨噬細胞核因子(NF)-κB的活化，改善脂多糖誘導的炎癥反應〔6〕。既往研究證實，NF-κB激活后，促進腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的表達與分泌，顯著促進LN的發展〔6〕。鑒于染料木素有調節免疫反應的功能，且染料木素在LN中作用未見報道，因此，本研究擬通過MRL/lpr構建LN小鼠模型，觀察染料木素對LN的影響并探討可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 本實驗所用一抗均來自Cell Signaling Technology(Beverly,MA USA)公司。染料木素(純度≥98%)購自上海融禾公司，ELISA試劑盒購自上海藍基生物公司，染色試劑盒由北京海德創業公司提供。

1.2方法

1.2.1動物及實驗分組 實驗動物均由南京大學-南京生物醫藥研究院提供。實驗遵守實驗動物規范條例。分為對照組：15只C57BL/6雌性小鼠，鹽水灌胃8 w；模型組： 15只純種MRL/lpr 雌性小鼠，鹽水灌胃8 w；治療組：15只純種MRL/lpr 雌性小鼠，染料木素灌胃100 mg/(kg·d)治療8 w〔7〕。

1.2.2尿蛋白檢測 根據BCA試劑盒檢測方法，通過代謝籠收集小鼠第10周、第12周、第14周、第16周和第18周尿液標本，使用 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒進行。

1.2.3免疫球蛋白(Ig)G 沉積 通過免疫熒光觀察IgG在腎內沉積情況。使用冰凍切片滴加 Alexa Fluor-546 標記的 IgG 抗體，室溫避光孵育2 h。封片后拍照分析。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色 石蠟切片脫蠟后HE染色，觀察腎小球硬化、增生及炎癥細胞浸潤。

1.2.5ELISA檢測 收集小鼠腎臟組織及血清，根據ELISA試劑盒檢測方法，配置梯度標準品與檢測試劑，96孔板種加入樣品及對照品，每孔100 μl，一抗過夜孵育后加入辣根過氧化物酶(HRP)-Streptavidin工作液，室溫孵育后苯胺(TMB)顯色，最后加入終止液 50 μl，酶標儀檢測分析各組血清及腎組織中抗ds-DNA、IL-1β、TNF-α尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)的含量。

1.2.6Western印跡 小鼠腎臟組織勻漿后提取蛋白。通過核蛋白提取試劑盒分離核蛋白。上樣、電泳、轉膜、封閉后加入一抗〔IκB的磷酸化(p-IκB)、NF-κB、F4/80、趨化因子配體(CCL)2、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1〕。過夜孵育加入二抗后電化學發光劑(ECL)顯色，檢測并分析。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1尿蛋白測定 第10周、第12周、第14周模型組與治療組小鼠尿蛋白無明顯差異(P>0.05)，而第16周、第18周尿蛋白檢測結果顯示染料木素治療能夠明顯降低治療組尿蛋白含量(P<0.05)，而模型組尿蛋白含量呈時間依賴性升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組尿蛋白水平比較

2.2腎臟組織HE染色 經過染料木素干預后，治療組小鼠腎臟腎小球硬化、增生及炎癥浸潤情況明顯緩解，而模型組較對照組相比上述腎小球病理改變明顯加重。見圖1。

圖1 各組腎臟組織病理學觀察(HE，×400)

2.3IgG沉積情況 模型組小鼠腎小球IgG的熒光強度(123.2±17.1)與對照組(21.2±0.1)相比明顯增加，說明模型組小鼠腎小球大量IgG免疫復合物沉積，而染料木素干預后治療組小鼠腎小球IgG熒光強度(54.5±7.4)較模型組明顯降低(P<0.05)，結果說明染料木素能夠降低免疫復合物在腎小球中的沉積。見圖2。

2.4血清抗ds-DNA、BUN、Cr水平 模型組較對照組ds-DNA、BUN、Cr水平明顯增加(P<0.05)，而染料木素干預降低治療組小鼠其血清抗ds-DNA、BUN、Cr水平，說明染料木素降低SLE所導致的腎損傷(P<0.05)。見表2。

圖2 各組腎小球IgG免疫熒光染色(×400)

表2 各組抗dsDNA、BUN、Cr水平比較

2.5染料木素影響NF-κB的激活 模型組細胞質中p-IκB與對照組相比顯著增加，通過提取核蛋白進行檢測發現模型組相較于對照組NF-κB p65入核增加(P<0.05)，表示NF-κB活化在模型組中被顯著激活。治療組小鼠經過染料木素干預后抑制了p-IκB，并且抑制了NF-κB p65的入核(P<0.05)，結果表明染料木素能夠通過抑制NF-κB的激活干預LN的發生發展過程。見圖3，表3。

圖3 p-IκB與NF-κB在細胞核內外的表達

表3 p-IκB 與NF-κB在細胞核內外的表達

2.6染料木素對炎癥的影響 模型組與對照組小鼠相比，腎組織內F4/80、CCL2、NLRP3和Caspase-1蛋白表達明顯增加(P<0.05)，進而說明炎癥細胞及炎癥因子參與了LN的發生發展。而治療組抑制炎癥相關蛋白的增加(P<0.05)，提示染料木素抑制NLRP3的表達從而抑制了LN腎組織的炎癥細胞浸潤和炎癥因子的產生。見圖4，表4。

圖4 炎性蛋白在腎組織中的表達

表4 炎性蛋白相對表達定量

2.7染料木素對炎癥因子TNF-α和IL-1β的影響 染料木素干預后能夠明顯抑制SLE小鼠腎組織及血清TNF-α和IL-1β的增高(P<0.05)。見表5。

表5 腎組織與血清TNF-α及IL-1β水平

3 討 論

LN是導致SLE患者腎衰竭的主要原因。雖然目前已開發出多種免疫抑制劑治療LN，但仍有部分患者進展為終末期腎臟病，嚴重威脅了LN患者生命與健康〔8，9〕。目前研究認為免疫調節失衡是LN發生發展的關鍵。蛋白尿是LN腎功能惡化早期表現，本研究結果說明染料木素能夠改善腎小球的結構，恢復腎小球的功能，進一步解釋染料木素降低LN導致的蛋白尿增加。

以往的研究顯示NF-κB的激活與LN免疫失衡密切相關〔10〕。NF-κB是關鍵的炎癥啟動因子，其激活有賴于IKKβ活性使IκB磷酸化，激活后NF-κB進入細胞核內促進炎癥反應。研究顯示通過使用在IKK選擇性抑制劑抑制NF-κB活性，能夠限制改善LN導致的腎損傷〔9〕。在腎小管損傷研究中發現，抑制NF-κB能明顯緩解缺氧誘導的大鼠腎小管損傷〔11〕。同時，泛素結合蛋白ABIN1能夠負向調節NF-κB的活化〔12〕。利用ABIN1無活性小鼠研究發現，失活后的ABIN1刺激NF-κB活化，進而促進LN進展〔13〕。因此，NF-κB信號激活是LN發生發展的關鍵因素。本研究發現，染料木素能夠顯著抑制IκB磷酸化，LN導致的NF-κB核轉位明顯被抑制，因此染料木素可能通過抑制NF-κB的活化減輕LN導致腎損傷。

既往研究顯示，NF-κB是炎癥小體NLRP3的上游分子，促進NLRP3的激活從而介導LN的發生發展〔14〕。有文獻報道，通過抑制NLRP3在MRL/lpr小鼠中的表達，能夠減輕LN介導的腎臟炎癥反應〔14〕。NLRP3作為Caspase-1的上游，能夠激活Caspase-1的活化。以往研究表明，通過敲除Caspase-1能夠抑制LN的活動進展，并且抑制P2X7受體能夠顯著降低LN中NLRP3和Capase-1的表達，影響IL-1β的表達與活化，延緩LN腎功能惡化〔15〕。CCL2是巨噬細胞重要的炎癥趨化因子，促進其在腎臟組織內浸潤，巨噬細胞分泌炎癥因子參與LN的發生發展過程〔16〕。本實驗發現染料木素能夠抑制Caspase-1的激活及IL-1β和TNF-α的產生與釋放，同時能夠減低單核細胞趨化因子CCL2的表達，抑制巨噬細胞在腎臟內浸潤，減輕腎小球增生和硬化，達到保護LN腎功能的目的。染料木素抑制LN發展可能的機制是抑制NF-κB/NLRP3軸的激活，從而抑制LN腎內的炎癥反應，恢復腎臟內免疫平衡，保護腎臟結構和功能。