LncRNA NNT-AS1通過靶向miR-496調控卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲的分子機制

張欣萍 史天云 徐方方 徐全曉

(南陽市第一人民醫院 1婦科，河南 南陽 473000；2腫瘤分子生物學醫學重點實驗室)

卵巢癌是一種危害女性生殖系統的惡性腫瘤，由于女性生殖系統及內分泌的復雜性導致卵巢癌患者術后復發率增加〔1〕。因而探討卵巢癌發生及發展規律對改善患者預后具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種RNA聚合酶Ⅱ轉錄產物，研究顯示LncRNA表達變化與腫瘤發生及發展關系密切〔2〕。卵巢癌組織中LncRNA異常表達可促進癌癥發生及發展〔3〕。長鏈非編碼RNA 煙酰胺核苷酸轉氫酶-反義RNA1(LncRNA NNT-A S1)是一種新型LncRNA，研究發現LncRNA NNT-AS1在結腸癌細胞中呈高表達，下調LncRNA NNT-AS1表達后可抑制結腸癌細胞增殖、遷移及侵襲〔4〕。但LncRNA NNT-AS1在卵巢癌中的表達研究尚未見報道。LncRNA與微小核糖核酸(miRNA)可相互作用，并可通過調控一個或多個miRNA表達并參與蛋白質編碼過程進而形成住轉錄因子調控網絡〔5〕。通過生物學信息預測軟件發現LncRNA NNT-AS1可靶向調節微小核糖核酸(miR)-496，miR-496在骨肉瘤細胞中呈低表達，上調miR-496表達可抑制骨肉瘤細胞增殖及遷移〔6〕。目前國內外對LncRNA NNT-AS1與miR-496在卵巢癌發生及發展過程中的生物學功能尚未闡明，因此本研究通過體外培養卵巢癌SKOV3細胞探討LncRNA NNT-AS1與miR-496在卵巢癌下細胞增殖、遷移及侵襲中的作用及其可能機制，為靶向治療卵巢癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 卵巢癌細胞株SKOV3與正常卵巢上皮細胞株IOSE-80均購自中科院上海生科院細胞庫。miR-496 mimic、miR-496抑制物及其各自陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司；LncRNA NNT-AS1 siRNA及其陰性對照均購自美國Dharmacon公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；Matrigel購自上海偉進生物科技有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑購自日本TaKaRa公司；MTT檢測試劑盒購自上海東仁化學科技公司；逆轉錄試劑盒購自上海齊一生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自美國Sigma公司；熒光素酶活性檢測試劑盒及熒光素酶報告在載體均購自美國Promega公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與轉染 采用含有10%FBS的DMEM培養基培養SKOV3、IOSE-80細胞，置于恒溫培養箱內培養(37℃、5%CO2)，2 d更換一次培養液，待細胞密度達到70%左右時采用胰酶消化細胞進行傳代培養。收集對數生長期卵巢癌SKOV3細胞，接種于6孔板中，待細胞匯合度達30%左右時按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書進行轉染。采用瞬時轉染技術抑制LncRNA NNT-AS1表達即分別將LncRNA NNT-AS1 siRNA及其陰性對照轉染至SKOV3細胞，分別為si-NNT-AS1組、si-NC組。構建LncRNA NNT-AS1過表達載體即分別將pcDNA與 pcDNA-NNT-AS1轉染至SKOV3細胞，分別為pcDNA組、pcDNA-NNT-AS1組。將miR-496 mimic及其陰性對照轉染至 SKOV3細胞，分別為miR-496組、miR-NC組。將anti-miR-496及其陰性對照分別與si-NNT-AS1共轉染至SKOV3細胞，分別為si-NNT-AS1+anti-miR-NC組、si-NNT-AS1+anti-miR-496組。各組均于轉染24 h后更換培養液。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞LncRNA NNT-AS1、miR-496表達 細胞培養72 h后收集對數生長期細胞，加入Trizol試劑提取總RNA，參照逆轉錄試劑盒進行反轉錄，配置qRT-PCR反應體系：2×STBR Green Taq PCR Mix 5 μl，cDNA樣本1.6 μl，基因正反向引物各0.2 μl，ddH2O 3 μl。置于PCR儀反應，程序設置為95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，循環40次，72℃終延伸10 min。LncRNA NNT-AS1與miR-496均以U6為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算LncRNA NNT-AS1與miR-496相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 取各組對數生長期SKOV3細胞，利用培養液重懸細胞，調整密度為1.5×105/ml，接種于96孔細胞培養板，每孔接種細胞體積為20 μl，分別于接種24 h后加入MTT溶液(40 μl/孔)，繼續培養4 h后加入DMSO(200 μl/孔)，混勻后繼續培養24 h、48 h、72 h，波長為490 nm時檢測各孔細胞光密度(OD)值，OD值大小表示細胞增殖能力強弱，實驗均設置3次重復。

1.2.4Transwell遷移實驗 分別取各組對數生長期SKOV3細胞，采用不含FBS的培養液重懸細胞，調整細胞密度(1.5×105/ml)，以200 μl/孔的密度加入Transwell上室，含FBS的培養液加入Transwell下室(500 μl/孔)，置于培養箱繼續培養24 h，采用甲醇固定Transwell上室，結晶紫染色后用棉簽試去未穿過底膜細胞，顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野計算遷移細胞個數，實驗重復3次。

1.2.5Transwell侵襲實驗 Transwell侵襲實驗預處理：以1∶100稀釋Matrigel基質膠與無FBS培養基，浸泡侵襲小室后再加入基質膠(100 μl)，采用紫外線消毒殺菌過夜，同時在上下侵襲小室分別加入200 μl、600 μl無FBS培養基。待細胞生長匯合度達到80%左右時收集各組細胞，重懸細胞后調整細胞密度為1.5×105/ml，Transwell下室加入含FBS培養基，上室加入重懸細胞，繼續培養40 h，采用乙醇固定小室，結晶紫染色，擦去未侵入基質細胞，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察計數，實驗重復3次。

1.2.6雙熒光素酶實驗 分別將WT-NNT-AS1、MUT-NNT-AS1與miR-496 mimic共轉染至SKOV3細胞，放入培養箱繼續培養48 h，收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細胞中雙熒光素酶活性。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1LncRNA NNT-AS1和miR-496在卵巢癌SKOV3細胞和卵巢上皮細胞IOSE-80中的表達 采用qRT-PCR檢測卵巢癌SKOV3細胞與卵巢上皮IOSE-80細胞中LncRNA NNT-AS1、miR-496表達水平，與IOSE-80細胞相比，SKOV3細胞中LncRNA NNT-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)，miR-496表達水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 NNT-AS1和miR-496在SKOV3細胞和IOSE-80細胞中的表達

2.2抑制LncRNA NNT-AS1表達對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響 si-NNT-AS1組SKOV3細胞中LncRNA NNT-AS1表達水平顯著低于si-NC組(P<0.05)，提示轉染成功。MTT檢測結果顯示si-NNT-AS1組SKOV3細胞OD值明顯低于si-NC組(P<0.05)，見表2，表明LncRNA NNT-AS1沉默可抑制SKOV3細胞增殖。

表2 抑制 NNT-AS1表達對卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響

2.3抑制LncRNA NNT-AS1表達對卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲的影響 si-NNT-AS1組遷移細胞數目與侵襲細胞數目均顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖1，表3。表明抑制LncRNA NNT-AS1表達可抑制SKOV3細胞遷移及侵襲。

圖1 卵巢癌SKOV3細胞的遷移、侵襲(結晶紫染色，×200)

表3 抑制NNT-AS1表達對卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲的影響

2.4LncRNA NNT-AS1靶向調控miR-496的表達 利用生物信息網站預測LncRNA NNT-AS1可能與miR-496有相似結合位點序列，見圖2。雙熒光素酶報告基因結果顯示LncRNA NNT-AS1可抑制miR-496熒光素酶活性，見表4。采用qRT-PCR分別檢測抑制LncRNA NNT-AS1表達及LncRNA NNT-AS1過表達轉染后SKOV3細胞中miR-496表達變化，結果顯示si-NNT-AS1組miR-496表達水平(1.03±0.08)顯著高于si-NC組(0.39±0.04，P<0.05)，pcDNA-NNT-AS1組miR-496表達水平(0.17±0.03)顯著低于pcDNA組(0.42±0.04，P<0.05)。表明LncRNA NNT-AS1可負向調控miR-496表達。

圖2 NNT-AS1的3′UTR中含有與miR-1496互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5miR-496過表達對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響 分別將miR-496 mimic及陰性質粒轉染至SKOV3細胞，qRT-PCR檢測結果顯示miR-496組miR-496表達水平顯著高于miR-NC組(P<0.05)，細胞OD值、遷移細胞個數及侵襲細胞個數均顯著降低(P<0.05)，見表5，表明miR-496過表達可抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移及侵襲。

表5 miR-496過表達對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.6抑制miR-496表達逆轉了抑制NNT-AS1表達對SKOV3細胞增殖、遷移侵襲的作用 為了證明 LncRNA NNT-AS1是通過調控miR-496表達對SKOV3細胞的生物學功能發揮作用，將si-NNT-AS1與anti-miR-NC共轉染至SKOV3細胞，si-NNT-AS1與anti-miR-496共轉染至SKOV3細胞，qRT-PCR檢測顯示si-NNT-AS1+anti-miR-496組SKOV3細胞中miR-496表達水平顯著低于si-NNT-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，si-NNT-AS1+anti-miR-496組細胞OD值、遷移細胞數目及侵襲細胞數目均顯著高于si-NNT-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，見表6。

表6 抑制miR-496表達逆轉了抑制NNT-AS1表達對SKOV3細胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討 論

卵巢癌細胞遷移及侵襲是降低腫瘤治療效果及導致患者死亡的主要原因，腫瘤細胞遷移、侵襲過程與多種生物分子及調控通路的相互調節作用密切相關，目前研究卵巢癌細胞遷移及侵襲主要集中在神經營養因子及黏附因子等方面〔7〕。近年來，研究發現LncRNA可參與細胞增殖、凋亡及遷移等生物學過程，LncRNA表達異常可促進或抑制腫瘤發生及發展〔8,9〕。LncRNA在卵巢癌中的作用成為研究熱點，既往研究發現LncRNA H19與LncRNA FOXD2-AS1在卵巢癌組織或細胞中均呈高表達并可促進癌細胞增殖、遷移及侵襲〔10,11〕。關于LncRNA與miRNA在卵巢癌發生及發展過程中的具體作用研究較少，因此探討LncRNA與miRNA的相互作用有助于卵巢癌診斷及治療。

LncRNA NNT-AS1在胃癌細胞中呈高表達并可促進細胞增殖、抑制凋亡〔12〕。Li等〔13〕研究表明骨肉瘤細胞中LncRNA NNT-AS1表達水平升高并可通過抑制miR-320a表達進而促進骨肉瘤發生及發展。本研究結果提示LncRNA NNT-AS1可能在卵巢癌的發生過程中發揮癌基因作用。Wang等〔14〕研究發現LncRNA NNT-AS1可通過抑制miR-363表達進而促進胃癌細胞增殖及侵襲。沉默LncRNA NNT-AS1表達可抑制乳腺癌增殖及遷移等生物學過程，Li等〔15,16〕研究發現LncRNA NNT-AS1可增強肝細胞癌細胞增殖能力并抑制細胞凋亡，敲低LncRNA NNT-AS1可抑制細胞增殖并誘導下細胞周期阻滯。本研究結果說明LncRNA NNT-AS1可能主要通過增強SKOV3細胞增殖活性、遷移及侵襲能力進而參與卵巢癌發生及發展過程。應用starBase網站預測出LncRNA NNT-AS1可互補結合miR-496。LncRNA NNT-AS1可直接靶向調控miR-496表達。

miR-496在骨肉瘤組織及細胞中均呈低表達，miR-496過表達后可抑制骨肉瘤細胞遷移及侵襲〔17〕。相關研究表明miR-496表達降低還可促進乳腺癌發生及發展〔18〕。本研究結果提示miR-496可能在卵巢癌發生過程中發揮抑癌基因作用。周靜怡等〔19〕研究表明結腸癌細胞中miR-496表達水平降低，miR-496過表達可能通過抑制Wnt /β-catenin 通路進而抑制結腸癌細胞增殖及遷移。Li等〔20〕研究報道指出抑制Wnt /β-catenin通路可抑制卵巢癌細胞遷移及侵襲。說明miR-496可能通過抑制SKOV3細胞增殖、遷移及侵襲進而參與卵巢癌發生及發展。為驗證LncRNA NNT-AS1靶向調控miR-496表達進而促進卵巢癌發生發展，本研究共同抑制LncRNA NNT-AS1、miR-496表達觀察細胞活性、遷移及侵襲變化，結果說明抑制miR-496表達逆轉了抑制NNT-AS1表達對SKOV3細胞增殖、遷移侵襲的作用。提示LncRNA NNT-AS1可通過降低miR-496表達繼而促進SKOV3細胞增殖、遷移及侵襲過程。