miR-184靶向ZNRF3調控口腔鱗狀細胞癌增殖和轉移的分子機制

辛欣 綦成 王昕

(1山東大學第二醫院口腔科，山東 濟南 250000；2濟南市口腔醫院牙周黏膜病科)

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)具有侵襲能力強及惡性程度高等特點，由于OSCC患者極易發生淋巴結轉移導致手術治療效果差〔1〕。隨著現代醫療水平的不斷提高，可采用根治性手術輔助放化療及靶向治療等手段治療OSCC，但由于OSCC發病機制尚未完全闡明導致治療后患者生存率低及預后差〔2〕。因而探究OSCC細胞增殖及侵襲的生物學行為并尋找OSCC發生及發展相關的分子標志物可為靶向治療提供新方向。微小RNA-184(miR-184)在口腔鱗癌細胞中高表達，抑制miR-184表達增加藥物敏感性〔3～5〕。然而，miR-184表達變化對OSCC細胞增殖及轉移的分子機制仍未可知。用靶基因預測網站預測出ZNRF3可能是miR-184的靶基因，研究表明ZNRF3在食管鱗癌細胞、胃癌中低表達，上調ZNRF3表達可促進癌細胞凋亡〔6〕。相關研究表明口腔鱗狀細胞癌中ZNRF3低表達并可能起到抑癌作用〔7〕。然而miR-184是否可通過靶向調控ZNRF3表達進而影響OSCC細胞增殖、遷移及侵襲尚未有相關研究。本研究采用基因干擾技術沉默miR-184表達并分析miR-184表達變化對OSCC細胞增殖、遷移及侵襲的影響，驗證其是否可通過調控靶基因ZNRF3而發揮作用并初步探究其可能作用機制，為OSCC治療提供潛在靶標分子并可為基因治療手段提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 舌鱗癌細胞CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1細胞均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；正常口腔黏膜細胞(Normol)購自美國Sciencell公司。杜氏改良培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM2000轉染試劑盒及Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量試劑盒購自日本Takara公司；miR-184 mimic、anti-miR-184、miR-184陰性對照序列及ZNRF3 siRNA序列均購自上海吉瑪基因；β-actin、兔抗人ZNRF3一抗及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗均購自美國Cell Signaling公司；CDK4、細胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體均購自美國Abcame公司；基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9抗體均購自美國CST公司；鼠抗人β-catenin、E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、Vimentin單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；雙熒光素酶報告系統購自美國Progema公司；基質膠購自上海前塵生物科技有限公司；細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、電化學發光(ECL)液等蛋白免疫印跡所需試劑均購自中國碧云天生物技術研究所；噻唑藍(MTT)試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2細胞轉染及分組 CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1及正常口腔黏膜細胞放入含有10% FBS的DMEM培養基在37℃、5%CO2、相對濕度95%的培養箱內培養。將SCC-9細胞分為4組，陰性對照組(anti-miR-con組)：轉染陰性對照質粒；anti-miR-184組：轉染miR-184抑制劑；anti-miR-184+si-con組：共同轉染miR-184抑制劑與ZNRF3陰性對照質粒；anti-miR-184+si-ZNRF3組：共同轉染miR-184抑制劑與ZNRF3 siRNA序列，嚴格按照轉染試劑盒說明書進行操作，轉染48 h后收集各組細胞進行后續實驗研究。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-184及ZNRF3 mRNA表達水平 采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度，根據檢測結果配置反轉錄體系將RNA合成cDNA，參照qRT-PCR定量試劑盒說明書配置反應體系，包括cDNA模板2 μl/孔，SYBR Premix ExTaqⅡ12.5 μl/孔，miR-184與ZNRF3上下游引物各1 μl/孔，ddH2O 8.5 μl/孔補至25 μl。PCR擴增條件為1個循環(94℃ 5 min)與40個循環(94℃，30 s；60℃ 30 s；72℃ 30 s)；72℃終延伸10 min。miR-184以U6 small nuclearRNA(U6)為內參基因，ZNRF3以β-actin為內參基因，miR-184與ZNRF3 mRNA相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

1.4Western印跡檢測ZNRF3、CDK4、CyclinD1、MMP-3、MMP-9及β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達 收集細胞，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，加入蛋白裂解液，經12 000 r/min離心15 min后吸取上清，測定蛋白濃度，各蛋白樣品分別加入5倍上樣緩沖液，5 min后吸取各樣本30 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳實驗(80 V 30 min，120 V 90 min)，反應完成后轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用脫脂奶粉封閉2 h，分別加入ZNRF3、CDK4、CyclinD1、MMP-3、MMP-9及β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，5 min/次，室溫條件下加入二抗孵育1 h，TBST洗滌5次，5 min/次，ECL化學發光試劑進行顯色反應，置于凝膠成像系統分析各蛋白灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.5熒光素酶報告實驗 利用在線數據庫預測ZNRF3的3′UTR端存在miR-184的結合位點，克隆ZNRF3上與miR-184結合的序列，構建重組熒光素酶報告基因質粒pGL3-ZNRF3-3′UTR，改變ZNRF3中預測結合片段而建立pGL3-ZNRF3-3′UTR-mut突變熒光素酶報告基因載體，WT-ZNRF3與MUT-ZNRF3均經雙酶切電泳反應鑒定，采用LipofectamineTM2000轉染試劑分別將WT-ZNRF3、MUT-ZNRF3與miR-184 mimic共轉染SCC-9細胞，轉染48 h后按照熒光素酶檢測試劑盒分別檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.6MTT檢測細胞增殖 收集SCC-9細胞胰蛋白酶消化后調整細胞濃度為5×104個細胞/ml，以每孔1×105個細胞接種于96孔板，用脂質體法分別或共同轉染anti-miR-184、si-ZNRF3、anti-miR-con、si-con，轉染方法及分組均參照“1.2”，分別在24、48、72 h加入質量濃度為5 g/L的MTT溶液(20 μl/孔)，繼續培養4 h，棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻，應用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度(OD)值。實驗設置3次重復。

1.7Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 預備：無血清DMEM培養基以1∶6稀釋比稀釋基質膠，4℃冰箱內孵育過夜，次日取100 μl稀釋液置于Transwell小室上室；細胞處理：收集各組對數生長期SCC-9細胞，胰蛋白酶消化細胞制備細胞懸液，調整細胞密度為2×105/ml，取200 μl細胞懸液置于鋪滿基質膠的Transwell小室的上室；觀察與計數：室溫孵育24 h后用棉簽除去基質膠及Transwell小室的上室細胞，用預冷多聚甲醛固定20 min，結晶紫溶液染色5 min，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數。細胞遷移實驗：除去“預備”實驗步驟外，其余實驗步驟均與細胞侵襲實驗相同。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1舌鱗癌細胞中miR-184和ZNRF3的表達 qRT-PCR實驗結果顯示舌鱗癌細胞系CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1中miR-184表達水平相較于正常口腔黏膜細胞(Normol組)顯著升高(P<0.05)，而ZNRF3 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，同時Western印跡實驗檢測結果顯示舌鱗癌細胞系CAL27、SCC-15 、SCC-9、UM1中ZNRF3蛋白表達顯著低于Normol組(P<0.05)，見圖1、表1。與CAL27、SCC-15、UM1細胞相比，SCC-9細胞中miR-184與ZNRF3表達均處于中等水平，因此選取SCC-9細胞進行后續實驗。

2.2miR-184靶向調控ZNRF3的表達 應用靶基因預測網站檢測出miR-184與ZNRF3之間可能存在堿基互補配對關系(圖2)，通過構建野生型ZNRF3真核表達載體WT-ZNRF3與突變型ZNRF3真核表達載體MUT-ZNRF3，分別與miR-184 mimic共轉染SCC-9細胞，雙熒光素酶報告實驗顯示，共轉染WT-ZNRF3與miR-184 mimic的SCC-9細胞熒光素酶活性呈顯著性下降(P<0.05)，而共轉染MUT-ZNRF3與miR-184 mimic的SCC-9細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，進一步采用Western印跡實驗檢測分別轉染miR-184 mimic、anti-miR-184的SCC-9細胞中ZNRF3蛋白表達，結果顯示轉染anti-miR-184的SCC-9細胞中ZNRF3蛋白表達(0.55±0.03)高于miR-con組(0.25±0.04),差異有統計學意義(P<0.05)，而轉染miR-184 mimic的SCC-9細胞中ZNRF3蛋白表達(0.11±0.06)低于anti-miR-con組(0.34±0.03)，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-184組WT-ZNRF3(0.62±0.07)顯著低于miR-con組(1.00±0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)，而兩組MUT-ZNRF3無明顯變化，見圖3。

圖1 檢測舌鱗癌細胞株中ZNRF3的表達

表1 舌鱗癌細胞株中miR-184和ZNRF3的表達

圖2 miR-184靶向ZNRF3 3′UTR表達

圖3 miR-184靶向調控ZNRF3蛋白的表達

2.3轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3對舌鱗癌細胞SCC-9增殖的影響 抑制miR-184表達后SCC-9細胞ZNRF3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，沉默ZNRF3后SCC-9細胞ZNRF3蛋白表達顯著降低(P<0.05)。與anti-miR-con組比較，anti-miR-184組SCC-9細胞OD值(48、72 h)及CDK4、CyclinD1蛋白表達顯著低于anti-miR-con組(P<0.05)，沉默ZNRF3后SCC-9細胞OD值(48、72 h)及CDK4、CyclinD1蛋白表達顯著高于anti-miR-184+si-con組(P<0.05)，見圖4、表2。

2.4轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3對舌鱗癌細胞SCC-9遷移和侵襲的影響 與anti-miR-con組比較，anti-miR-184組SCC-9細胞遷移及侵襲數均顯著減少(P<0.05)，Western印跡檢測顯示anti-miR-184組SCC-9細胞MMP-3、MMP-9蛋白表達顯著低于anti-miR-con組(P<0.05)。與anti-miR-184+si-con組比較，anti-miR-184+ si-ZNRF3組SCC-9細胞遷移及侵襲數顯著增加(P<0.05)，而MMP-3、MMP-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，見表3，圖5，圖6。

1～4：anti-miR-con組、anti-miR-184組、anti-miR-184+si-con組、anti-miR-184+si-ZNRF3組；同圖6，圖7圖4 轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3對舌鱗癌細胞SCC-9增殖蛋白的影響

表2 轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3對舌鱗癌細胞SCC-9增殖和細胞增殖蛋白表達的影響

表3 miR-184和ZNRF3表達對舌鱗癌細胞SCC-9遷移蛋白的影響

圖5 transwell檢測舌鱗癌細胞SCC-9遷移和侵襲(×200)

圖6 Western印跡檢測舌鱗癌細胞SCC-9轉移相關蛋白表達

2.5轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3對舌鱗癌細胞SCC-9 EMT的影響 上皮-間質轉化(EMT)與腫瘤細胞遷移及侵襲有關，通過在SCC-9細胞中轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3，觀察其對SCC-9細胞EMT的影響，由圖7、表4可知，anti-miR-184組SCC-9細胞上皮表型標志物β-catenin、E-cadherin蛋白表達明顯升高(P<0.05)，而間質表型標志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達明顯下降(P<0.05)。進一步研究顯示，anti-miR-184+ si-ZNRF3組SCC-9細胞β-catenin、E-cadherin蛋白表達顯著下調(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達顯著上調(P<0.05)。

圖7 β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達

表4 轉染anti-miR-184和沉默ZNRF3對舌鱗癌細胞SCC-9 β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響

3 討 論

OSCC屬于頭頸部常見惡性腫瘤之一，目前早期診斷及治療OSCC成為重要難題〔8〕。miRNA在疾病診斷及治療方面均具有一定應用價值，可通過降解靶基因表達進而調控多種腫瘤細胞增殖、凋亡等多種生物學過程〔9〕。研究表明miRNA異常表達可調控OSCC發生及發展過程，并可作為臨床診斷及治療的重要分子標志物〔10〕。以上研究結果表明miRNA在OSCC發生及發展過程中扮演重要角色，深入探究其對OSCC細胞增殖、遷移等惡性生物學行為的影響可為進一步揭示OSS發病機制奠定基礎。

miR-184在骨肉瘤細胞中呈高表達，抑制miR-184表達可抑制骨肉瘤細胞增殖及遷移，并誘導細胞凋亡〔11〕。Zhu等〔12〕研究表明，miR-184在鼻咽癌細胞中表達降低，通過上調miR-184表達后可直接靶向調控Notch2表達進而抑制鼻咽癌細胞遷移及侵襲。Wang等〔13〕研究表明前列腺癌細胞中miR-184呈低表達，而長鏈長非編碼RNAMYU可通過競爭性結合miR-184而上調靶基因表達進而促進前列腺癌細胞增殖。Li等〔14〕研究表明miR-184在慢性粒細胞白血病細胞中呈高表達，長鏈長非編碼RNAMEG3通過抑制miR-184表達進而抑制慢性粒細胞白血病中的細胞增殖和轉移。由上述研究報道結果可推測不同腫瘤細胞中miR-184表達變化不同，然而關于miR-184在OSCC細胞中的表達及其可能作用機制研究相對較少，本研究結果提示miR-184可能在OSCC發生過程中發揮癌基因作用。采用基因干擾技術沉默miR-184表達，結果發現SCC-9細胞增殖活性明顯降低，為闡明miR-184在SCC-9細胞增殖過程中的功能機制，本研究結果發現CyclinD1作為細胞周期重要調節因子，其可與CDK4結合形成復合物進而促使細胞周期由G1期進展轉變為S期〔15〕。提示沉默miR-184可通過下調CDK4、CyclinD1蛋白表達進而抑制SCC-9細胞增殖，同時可誘導細胞周期停滯于G2/M期。進一步探討miR-184與SCC-9細胞遷移及侵襲能力的關系，結果顯示沉默miR-184顯著降低SCC-9細胞遷移及侵襲能力。MMP-3、MMP-9屬于MMPs家族成員，可通過降解細胞外基質而破壞細胞基底膜進而為腫瘤細胞遷移及侵襲提供有利條件〔16〕。提示沉默miR-184可能通過降低MMP-3、MMP-9蛋白表達而抑制SCC-9細胞遷移及侵襲。

ZNRF3在胃癌細胞中呈低表達，并可通過拮抗Wnt和Hedgehog信號通路誘導胃癌細胞凋亡〔17〕。ZNRF3在乳頭狀甲狀腺癌中下調表達，并可抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和侵襲〔18〕。Wang等〔19〕研究表明ZNRF3可通過抑制Wnt/β-連環蛋白信號通路進而抑制鼻咽癌細胞增殖及侵襲。然而，ZNRF3在OSCC細胞中表達變化及其可能作用機制研究相對較少，本研究結果顯示舌鱗癌細胞CAL27、SCC-15、SCC-9、UM1中ZNRF3均呈低表達，與上述研究報道中ZNRF3表達變化趨勢相似，提示ZNRF3表達水平降低可能促進OSCC發生。通過雙熒光素酶報告實驗驗證ZNRF3是miR-184的靶基因，為闡明miR-184是否通過調控ZNRF3表達而影響SCC-9細胞生物學行為，本研究結果說明沉默miR-184可通過上調ZNRF3表達進而抑制SCC-9細胞增殖、遷移及侵襲，其可能通過降低CDK4、CyclinD1、MMP-3、MMP-9蛋白表達而實現。EMT轉化進程可促進OSCC細胞遷移及侵襲并可作為患者預后不良的重要影響因素〔20〕。β-catenin、E-cadherin等上皮表型標志物表達降低與N-cadherin、Vimentin等間質表型標志物表達升高可導致細胞骨架重構并減弱細胞間黏附力進而促進細胞遷移及侵襲，通過抑制EMT可抑制OSCC增殖及侵襲〔21，22〕。本研究結果說明沉默miR-184可通過調控ZNRF3進而上調β-catenin、E-cadherin蛋白表達及下調N-cadherin、Vimentin表達。提示miR-184可能通過調控靶基因ZNRF3影響OSCC細胞EMT轉化進程進而促進細胞遷移及侵襲過程。