NLRP3基因多態性與慢性阻塞性肺疾病的相關性

賈欽堯 陳紹平 宋珊 韓美玲 李新勝

(川北醫學院 1藥學院，四川 南充 637000；2附屬醫院呼吸內科；3武漢市肺科醫院；4安康市人民醫院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床常見的以持續性氣流受限為主要特征的慢性炎癥性疾病，患者存在不同程度的進行性肺功能降低及異常的對氣體和有毒顆粒的炎癥反應，具有較高的發病率〔1〕。COPD的影響因素眾多，包括天氣、吸煙、感染、物理因素、化學因素等，其與機體免疫系統互相作用會誘發氣道慢性持續炎癥，導致氣道不完全阻塞和狹窄，支氣管軟骨受到破壞，肺組織彈性降低等，最終導致通氣功能下降。慢性氣道炎癥反應被認為在COPD發生發展中發揮著核心作用。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(NLRP)3是參與炎癥反應的重要蛋白，研究已經發現COPD患者中NLRP3表達異常，其可能在COPD發生發展中發揮重要作用〔2〕。王蕾等〔3〕研究發現NLRP3的表達與COPD疾病的嚴重程度密切相關。基因多態性是指存在兩種或多種不連續的變異型、基因型或等位基因，NLRP3基因的多態性與多種炎性疾病有關，包括類風濕關節炎、阿司匹林誘發哮喘等，但目前有關NLRP3基因與COPD之間的關系還未見研究報道〔4，5〕。本研究分析了4個近年來NLRP3基因和疾病相關研究的熱點區域，包括rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419，應用TaqMan探針檢測法檢測這4個位點的單核苷酸多態性，分析NLRP3基因的多態性與COPD的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機選擇2017年10月至2018年10月在川北醫學院附屬醫院確診的COPD患者共200例作為研究組，年齡52～73歲，平均(64.78±4.03)歲，選擇同期健康者60例作為對照組，年齡55～74歲，平均(65.28±3.99)歲，兩組的一般資料差異無統計學意義。本研究已經獲得倫理委員會批準。

1.2納入和排除標準 納入標準：(1)年齡18～75歲；(2)符合COPD的診斷標準〔1〕；(3)資料完整；(4)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并肺結核、哮喘、支氣管擴張等疾病；(2)合并其他部位感染；(3)合并惡性腫瘤。

1.3研究指標 患者在門診接受問卷調查，收集患者一般資料，其中吸煙定義為每日吸煙量>10支，吸煙時間>10年；飲酒定義為飲酒量為4個標準杯(56°白酒100 ml)，每周飲酒超過5次，飲酒時間超過5年。抽取患者外周靜脈血共10 ml，通過PCR-RFLP 技術檢測NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4個位點的單核苷酸多態性。使用酚-氯仿法從外周血淋巴細胞中提取所有參與者的基因組DNA。通過NanoDrop-2000c(Thermo Scientific，USA)檢測提取的DNA的濃度。使用0.2 μl光學96孔反應板(ABI 7300，Biosystems，USA)進行NLRP3(rs10754558，rs3806265，rs4612666和rs35829419)基因分型。每個微孔中的總體積為20 μl，由10 μl的MasterMix(ABI 7300，Biosystems，USA)，0.5 μl AssayMix(ABI)，4.5 μl去離子水和5 μl DNA樣品(20 ng/ml)組成。制備含有1 000 MasterMix(2×)，50 μl AssayMix(4×)和450 μl去離子水的混合物，將15 μl混合物和5 μl DNA樣品加入每個微孔中。 PCR條件如下：95℃、10 min，40個循環，95℃、15 s，60℃、1 min，使用等位基因辨別程序確定結果。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、F檢驗、χ2檢驗、Logistic回歸分析、Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結 果

2.1兩組基本資料比較 研究組吸煙比例顯著高于對照組(P<0.05)，其他指標無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.2兩組NLRP3基因多態性分布比較 研究組NLRP3基因rs3806265位點的等位基因T的頻率顯著高于對照組(P<0.001)，研究組NLRP3基因rs3806265位點TT的基因型顯著高于對照組(P<0.001)，CT基因型顯著低于對照組(P<0.001)，其他點位基因多態性無顯著差異，見表2。

表1 兩組基本資料比較

表2 兩組NLRP3基因多態性分布比較〔n(%)〕

2.3COPD危險因素 Logistic 回歸分析 Logistic 回歸分析結果顯示吸煙〔OR=3.056,95%CI(1.956～6.757);P=0.011〕和rs3806265位點TT基因型〔OR=2.341,95%CI(1.194～4.689);P=0.023〕是COPD的危險因素(P<0.05)。

3 討 論

COPD在臨床上常表現為咳嗽咳痰、氣喘、呼吸困難，COPD患者若得不到有效的救治會誘發嚴重炎癥反應及肺的纖維化，甚至導致呼吸衰竭，嚴重危害患者的生命健康。我國是COPD高發國家，COPD在40歲以上人群發病率高達8.2%，并且隨著空氣環境污染等原因，COPD的發病率有上升趨勢〔6〕。但是目前關于COPD的發病機制尚不明確，基因多態性可能是引起COPD的因素之一。

NLRP3是NLRPs蛋白家族中的典型成員，組成包括C-端亮氨酸重復序列、N-端PYD結構域和中間的NACHT結構域。經C-端亮氨酸重復序列，NLRP3可識別三磷酸腺苷(ATP)、胞壁酰二肽(MDP)、內毒素、尿酸、細胞裂解產物等配體，使其被激活并進一步導致其構象發生變化，通過其PYD結構域這一效應結構域其可募集帶有天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)募集結構域(CARD)的Caspase-1和凋亡相關的斑點樣蛋白(ASC)，形成NLRP3炎性體這一復雜的復合物。研究發現，NLRP3參與膿毒癥等炎性疾病的發生和發展密切相關〔7〕。NLRP3可激活Caspase-1，激活的Caspase-1會進一步激活白細胞介素(IL)-1β和IL-18，導致促炎反應，氧化應激反應、炎性因子會激活NLRP3，最終引起各種免疫炎癥反應〔8〕。目前，NLRP3在慢性炎癥反應、無菌性炎癥反應和自身免疫性疾病等病理過程中的意義和作用備受關注，很多感染性疾病和自身免疫性疾病都涉及到NLRP3炎性體-Caspase-1-IL18/IL-1β軸的激活。

NLRP3基因的多態性參與多種炎性疾病的發生，研究發現rs10754558 隱性模型是哈薩克族老年原發性高血壓高危因素〔9〕。李賽等〔10〕研究認為山東漢族人群NLRP3基因rs2027432位點多態性與子癇前期的發生有關。國外也有研究顯示NLRP3基因rs4612666多態性與大動脈粥樣硬化性缺血性腦卒中和微栓子信號的發生有關〔11〕。Zhou等〔12〕研究認為NLRP3 rs10754558多態性與中國漢族人群冠狀動脈病變的發生及預后相關。已經有研究證實NLRP3參與COPD的發生和COPD急性加重期的發生〔13〕，但是關于NLRP3基因多態性與COPD的研究極少。為了進一步探討NLRP3基因多態性與COPD的關系，本次研究共分析了NLRP3基因的rs10754558、rs3806265、rs4612666和rs35829419 4個對中國漢族人群重要的單核苷酸多態性(SNPs)位點的單核苷酸多態性，其中rs10754558被指出與人類免疫缺陷病毒(HIV)感染易感性有關，rs3806265被認為與葡萄膜炎的發病有關，rs4612666和rs35829419則被指出與骨髓增生異常綜合征、痛風等的易感性有關。Yu等〔14〕研究發現NLRP3基因rs3806265位點的多態性與銀屑病的發生有關。Bidoki等〔15〕的研究也發現復發性口瘡性口炎患者NLRP3 rs3806265 TT基因型的高頻率與其易感性有關。本研究提示rs3806265位點TT基因型是可能COPD的危險因素。這一結果證實，rs3806265 SNP位點的遺傳多態性可能會增加COPD的風險，TT基因型是COPD發病的危險因素。過往已經有研究顯示吸煙是引起COPD的危險因素〔16〕。研究顯示吸煙是激活NLRP3炎性小體的因素之一〔17〕。Han等〔18〕研究顯示香煙煙霧提取物通過增加泛素介導的蛋白酶體加工調節NLRP3蛋白豐度，這提示吸煙與NLRP3和COPD的發生有關，因此，推測分析NLRP3基因的多態性可能是連接吸煙和COPD的中間環節。