痰樣分離的高黏液型肺炎克雷伯菌耐藥性及毒力基因檢測

胡久麗 肖旭 朱孝芹 辛春蘭 胡潺潺 李國蕓

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1臨床藥學(xué)部，承德 067000；2腫瘤科；3科研處)

老年呼吸系統(tǒng)感染的主要病原菌為革蘭陰性菌，最為常見的是銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌〔1〕。其中高黏液型肺炎克雷伯菌具有高侵襲性，由于老年人免疫功能衰退，容易形成反復(fù)感染，是臨床頗為棘手的一大難題〔2〕。目前，臨床上治療肺炎克雷伯菌的主要是碳青霉烯類抗菌藥物，但近年碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的檢出率越來越高〔3，4〕。2015～2016年度衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(Mohnarin)的檢測數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南和比阿培南的耐藥率分別為14.6%、14.4%及15.8%〔5〕，如何克服肺炎克雷伯菌的耐藥性成為亟待解決的一大難題。本研究分析135株自老年呼吸道感染患者痰樣中分離出的高黏液型肺炎克雷伯菌，對毒力基因和其耐藥進(jìn)行總結(jié)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 135株高黏液型肺炎克雷伯菌來源于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2017年1月至2018年12月送檢的痰液樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 患者>60歲；②出現(xiàn)呼吸道感染癥狀；③ 黏液絲試驗(yàn)檢測結(jié)果為高黏液表型；④患者自愿簽署知情同意書。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853 和肺炎克雷伯ATCC700603均購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2主要試劑與儀器 Luria-Bertani培養(yǎng)基(賽默飛世爾)；DNA抽提試劑盒(碧云天)；DNA Marker DL 2000(寶生物)；PCR擴(kuò)增試劑盒(賽默飛世爾)；瓊脂糖(寶生物)；核糖核酸酶(寶生物)；紫外分光光度計(jì)(日立)；自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)(貝克曼庫爾特)；低溫冷凍離心機(jī)(貝克曼庫爾特)；凝膠成像分析系統(tǒng)(日立)；PCR儀(賽默飛世爾)；水平電泳儀(六一儀器)等。

1.3超廣譜β-內(nèi)酰胺酶活性(ESBLs)和耐藥性檢測方法 ESBLs活性和耐藥性實(shí)驗(yàn)參照中華人民共和國衛(wèi)生部推薦的“紙片擴(kuò)散法及操作標(biāo)準(zhǔn)”〔6〕進(jìn)行判定，測定阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等15種抗菌藥物的耐藥性。

1.4毒力基因檢測方法 采用PCR實(shí)驗(yàn)測定肺炎克雷伯菌的7種莢膜血清型和11種毒力基因。主要步驟：(1)所得菌種，接種至Luria-Bertani培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h；借助顯微鏡，用接種鑷子挑取單菌，再次培養(yǎng)12 h，獲得活化的肺炎克雷伯菌，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期。(2)采用DNA抽提試劑盒提取肺炎克雷伯菌的DNA，提取過程和純化過程均按照試劑盒說明書操作；所得DNA最終溶解于TE緩沖液(1 mmol/L Tris-HCl+0.5 mmol/L EDTA，PH 8.0，現(xiàn)用現(xiàn)配)。(3)紫外可見光分光光度計(jì)下側(cè)定DNA的濃度和純度，以O(shè)D260/OD280=1.8～2.0為合格標(biāo)準(zhǔn)，納入PCR。(4)在無菌工作臺和PCR板上操作，根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒說明書要求配置30 μl PCR體系，其中7種莢膜血清型(wzyK1、wzyK2、wzyK3、wzxK5、wzyK20、wzxK54、wzyK57)的引物及擴(kuò)增條件參照Zhang等〔7〕報道結(jié)果，12種毒力基因(magA、ureA、aerobactin、iroN、mrkD、fimH、wcaG、entB、p-rmpA、p-rmpA2、alls、iutA)的引物及擴(kuò)增條件參照Guo等〔8〕報道結(jié)果進(jìn)行操作。(5)本研究所需引物均委托上海生工合成，所得產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ESBLs活性和耐藥性檢測結(jié)果 本次檢測的135株高黏液型肺炎克雷伯菌共檢出ESBLs陽性菌36株(26.7%)，ESBLs陰性菌99株(73.3%)。ESBLs陽性菌對5種頭孢菌素、左氧氟沙星、妥布霉素、氨曲南、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率明顯高于ESBLs陰性菌(P<0.05)，其中對頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、氨曲南及阿莫西林/克拉維酸的耐藥性高達(dá)100%；無論是ESBLs陽性菌還是ESBLs陰性菌，其主要敏感抗菌藥物為亞胺培南和美羅培南，耐藥率分別為1.5%和4.4%，對妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星的耐藥率在20%以內(nèi)，也可以作為臨床治療的可選藥物。見表1。

表1 135株高黏液型肺炎克雷伯菌的耐藥性〔n(%)〕

2.2莢膜血清型基因測定結(jié)果 135株高黏液型肺炎克雷伯菌共檢出wzyK2型40株(29.6%)，wzyK1型20株(14.8%)，wzyK57型15株(11.1%)，wzxK54型11株(8.1%)。ESBLs陽性菌與ESBLs陰性菌之間各個莢膜血清型未無明顯差異(P>0.05)。見表2。

2.3毒力基因測定結(jié)果 135株高黏液型肺炎克雷伯菌，毒力基因的檢出率偏高，其中aerobactin和mrkD的檢出率最高，分別為82.2%和89.6%，iroN、fimH、wcaG、p-rmpA的檢出率也在70%以上。其中ESBLs陽性菌aerobactin、iroN、wcaG的檢出率均明顯低于ESBLs陰性菌(P<0.05)；其他類型的毒力基因無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表2 135株高黏液型肺炎克雷伯菌的莢膜血清型分布〔n(%)〕

表3 135株高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力基因分布〔n(%)〕

3 討 論

研究表明〔9〕，肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制較多，ESBLs和碳青霉烯酶是目前已發(fā)現(xiàn)的主要耐藥酶，前者可抵抗頭孢菌素和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，后者可抵抗幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。結(jié)果與其他學(xué)者的報道〔10，11〕結(jié)果基本一致，均支持ESBLs陽性菌耐藥性增強(qiáng)這一結(jié)論。然而，臨床用藥的實(shí)際情況與藥敏實(shí)驗(yàn)稍有出入，這主要是因?yàn)樗幟魧?shí)驗(yàn)測試的對象是游離細(xì)菌，而很難反映出生物膜的作用及細(xì)菌在人體內(nèi)環(huán)境中與免疫系統(tǒng)的相互作用，這解釋了為什么毒力基因是近年廣受關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前，國際上關(guān)于毒力基因并沒有權(quán)威定義。一般認(rèn)為，莢膜多糖是肺炎克雷伯菌最重要的毒力因子，可包裹菌體，抵抗宿主免疫細(xì)胞和藥物作用。根據(jù)莢膜多糖血清分型，可將肺炎克雷伯菌分為至少78個血清型，其中與高黏液型相關(guān)的主要有K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57等〔12〕。本研究結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者近幾年報道的流行病學(xué)趨勢大體一致〔13，14〕，均認(rèn)為wzyK1、wzyK2、wzxK54、wzyK57型菌株的毒力和流行趨勢頗為嚴(yán)峻，需重點(diǎn)控制。另外，本研究與國內(nèi)學(xué)者余倩等〔15〕報道結(jié)果稍有出入，余倩等〔15〕發(fā)現(xiàn)攜帶高毒力因子wzyK1/wzyK2/wzyK57的多為ESBLs陰性菌。這可能是由于不同樣本來源的肺炎克雷伯菌莢膜血清分型分布趨勢不一致所致，余倩等〔15〕應(yīng)用的是血液樣本，而本研究應(yīng)用的是痰樣樣本。因此，本研究認(rèn)為在分析高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力基因時，對不同來源的樣本做比對分析也較為重要，利于為臨床用藥提供更準(zhǔn)確的參考信息。

除了莢膜多糖以外，其他能夠提高肺炎克雷伯菌侵襲能力的基因，如利于生物膜形成、促進(jìn)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)或菌毛形成的基因也被作為肺炎克雷伯菌的毒力基因，本研究曬選了臨床報道較多的12個毒力基因進(jìn)行測試，結(jié)果與魏丹丹等〔16〕報道的尿液分離的高黏液型肺炎克雷伯菌檢測結(jié)果基本一致。p-rmpA和p-rmpA2均屬于黏液調(diào)控因子的一種，既往研究證實(shí)，高毒力的肺炎克雷伯菌可通過促進(jìn)p-rmpA 和p-rmpA2表達(dá)提高莢膜的形成能力。汪強(qiáng)等〔17〕對肝膿腫分離的高毒力肺炎克雷伯菌的分析結(jié)果顯示p-rmpA和wcaG是醫(yī)院分離的主要毒力基因型。wcaG是將甘露糖轉(zhuǎn)化為巖藻糖，進(jìn)而產(chǎn)生超級莢膜的必須基因，敲除wcaG的肺炎克雷伯菌同時也失去了形成莢膜的能力〔18〕。fimH與mrkD具有編碼細(xì)菌菌毛的功能，aerobactin和iroN可促進(jìn)鐵載體產(chǎn)生和鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)，這4種毒力基因在在肺炎克雷伯菌中也普遍存在〔19〕。既往也有學(xué)者指出〔20〕，ESBLs陰性菌某些毒力基因的攜帶率可能更高，因此高毒力基因的耐藥率也可能較低，與本研究結(jié)論一致。

綜上，老年呼吸道感染患者痰樣分離的高黏液型肺炎克雷伯菌耐藥性受ESBLs表達(dá)的影響，ESBLs陽性菌株的耐藥性雖然普遍偏高，但某些高毒力莢膜血清分型和毒力基因的攜帶率可能偏低，臨床用藥方面應(yīng)兼顧耐藥分析和毒力基因分布規(guī)律。