HMGB-1抑制劑甘草酸對(duì)急性心肌梗死大鼠炎性損傷及JAK/STAT、Wnt3a通路的影響

魯雪麗 張韓 姚新亮 郭晶晶 魯艷嬌 李彥明

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 開封 475000)

急性心肌梗死(AMI)屬于臨床常見心血管疾病，發(fā)病率、病死率逐年升高，嚴(yán)重危害人類身體健康〔1〕。心肌梗死發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，涉及多方面如環(huán)境、遺傳、氧化應(yīng)激、炎癥損傷等。酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)在心血管疾病發(fā)生機(jī)制中起著重要的調(diào)控作用，基礎(chǔ)研究認(rèn)為JAK/STAT通路抑制后可引發(fā)心肌組織損傷，進(jìn)而參與心肌梗死、心力衰竭等心臟相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展〔2〕。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活與心肌缺血、冠心病、心臟衰竭等疾病密切相關(guān)〔3,4〕。甘草酸是從植物甘草中分離的主要化學(xué)成分，具有較好的抗炎作用，且副作用較少，近期研究發(fā)現(xiàn)甘草酸可作為高遷移率族蛋白(HMGB)-1抑制劑，對(duì)腦損傷、腦缺血等血管疾病具有較好的抗炎作用〔5〕，然而甘草酸在心肌梗死中的作用目前尚不明確，本研究通過建立心肌梗死模型大鼠，并給予甘草酸干預(yù)，旨在探究其對(duì)心肌梗死大鼠心肌組織的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級(jí)，8周齡，體重180～200 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(豫)2018-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(豫)2018-0005，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為：0050472，統(tǒng)一環(huán)境下飼養(yǎng)，嚴(yán)格遵循動(dòng)物飼養(yǎng)守則，1 w后用于模型制備。

1.2主要試劑與儀器 卡托普利購自上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：20181227；HMGB-1抑制劑甘草酸購自浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，批號(hào)：20190115；TRIzol試劑購自美國Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：T9424；蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、氯化三苯基四氮唑(TTC)染液購自美國Solarbio公司，批號(hào)：PC0030、G3005；兔抗鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、HMGB-1單克隆一抗購自英國Abcam公司，批號(hào)：ab6604、ab5014、ab0037、ab1029、ab77302；兔抗鼠Wnt3a、β-catenin、β-actin一抗、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記IgG二抗購自美國R&D公司，批號(hào)：ST00648、ST5072、ST11354、ST2053；腫瘤壞死因子(TNF)-α、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：0011c、0253c；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0013A；Vevo 770型小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)購自加拿大visualsonics公司；DYCZ-25E型電泳儀器購自北京六一儀器廠；ChemiDocTM凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；BX43型倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司

1.3動(dòng)物模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)〔6〕建立心肌梗死模型大鼠。隨機(jī)選取60只大鼠進(jìn)行模型建立，經(jīng)腹注射戊巴比妥鈉(1%，40 mg/kg)充分麻醉大鼠，仰臥于手術(shù)操作臺(tái)上，氣管插管連接呼吸機(jī)，于沿左側(cè)第三肋間制作3 cm手術(shù)切口，逐步分離皮下組織，行左胸廓切開術(shù)，采取6-0無菌絲線在離左冠狀動(dòng)脈前降支根部1 mm部位進(jìn)行結(jié)扎，當(dāng)心電圖顯示ST段呈現(xiàn)弓形向上型抬高，證實(shí)心肌梗死模型建立成功。結(jié)扎后還納心臟，縫合切口，恢復(fù)自主呼吸后拔除呼吸機(jī)，每天使用10萬U青霉素抗感染，連續(xù)3 d。共50只大鼠造模成功，其余10只因操作不當(dāng)、感染等原因死亡。假手術(shù)組(n=10)僅穿線，不進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。

1.4動(dòng)物給藥與分組 造模成功后，將模型大鼠分為模型組、甘草酸低、中、高劑量組、卡托普利組，每組10只。甘草酸低、中、高劑量組：造模成功后，灌胃10、20、40 mg/kg甘草酸(將甘草酸用生理鹽水配置成濃度分別為1、2、4 mg/ml的溶液，灌胃體積為10 ml/kg)，每天1次，連續(xù)給藥4 w〔7〕；卡托普利組：造模成功后，灌胃6.25 mg/kg卡托普利(將卡托普利用生理鹽水配置成濃度分別為0.625 mg/ml的溶液，灌胃體積為10 ml/kg)，每天1次，連續(xù)給藥4 w〔8〕；假手術(shù)組、模型組均灌胃10 ml/kg的生理鹽水，每天1次，連續(xù)4 w。

1.5觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1超聲檢測(cè)大鼠心室功能變化情況 末次給藥結(jié)束后麻醉大鼠，在二維超聲模式下，對(duì)各組左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算左心室短軸縮短率(FS)，至少測(cè)定3個(gè)心臟周期，獲取平均值。

1.5.2樣本收集 超聲測(cè)定結(jié)束后，每組選取4只大鼠處死，迅速獲取心肌組織，用于TTC染色；各組剩余6只大鼠處死后，收集血液，3 000 r/min離心10 min后，置于-20℃中凍存，獲取心肌組織，部分置于4%多聚甲醛固定，另一部分在-20℃凍存。

1.5.3TTC染色觀察大鼠心肌組織梗死情況 將獲取的心肌組織用PBS溶液清洗后，將左心室沿冠狀方向切為5片，用1% TTC染液在37℃中染色20 min，隨后置于4%多聚甲醛中固定24 h，染白部分為梗死區(qū)域，用Image-J軟件定量分析梗死面積比，梗死面積百分比=染白區(qū)域面積/總面積×100%。

1.5.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況 取出固定的心肌組織，經(jīng)脫臘、脫水、包埋后制備心肌組織石蠟切片，參考HE染色試劑盒對(duì)組織切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察心肌組織病理變化情況。

1.5.5ELISA檢測(cè)血清中TNF-α、MCP-1水平 參照ELISA試劑盒說明書對(duì)各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.6Western印跡法檢測(cè)心肌組織中JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表達(dá)情況 取凍存梗死區(qū)域組織，用RIPA裂解液提取組織總蛋白，對(duì)蛋白濃度檢測(cè)后，用15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后，采取HMGB-1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt3a、β-catenin、β-actin的一抗抗體孵育膜，4℃冰箱中過夜，用HRP標(biāo)記二抗室溫下孵育膜2 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影，以β-actin為內(nèi)參，使用Image-J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行掃描，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析，SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1甘草酸對(duì)心肌梗死大鼠心室功能的影響 與假手術(shù)組相比，模型組LVEDD、LVESD明顯升高，LVEF、FS明顯降低(均P<0.05)。與模型組相比，甘草酸各劑量組、卡托普利組LVEDD、LVESD明顯降低，LVEF、FS明顯升高(均P<0.05)；隨著甘草酸劑量的增加，甘草酸各劑量組LVEDD、LVESD逐漸降低，LVEF、FS逐漸升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。甘草酸高劑量組與卡托普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠心室功能有關(guān)指標(biāo)比較

2.2甘草酸對(duì)心肌梗死大鼠心肌梗死面積的影響 與假手術(shù)組〔(3.47±0.38)%,n=4〕相比，模型組心肌梗死面積比例明顯升高〔(39.93±4.41)%，P<0.05〕。與模型組相比，甘草酸低、中、高劑量組、卡托普利組心肌梗死面積比例明顯降低〔(32.52±4.33)%、(26.28±3.47)%、(20.18±3.46)%、(19.04±3.35)%，均n=4，P<0.05〕；隨著甘草酸劑量的增加，甘草酸各劑量組心肌梗死面積比逐漸降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。甘草酸高劑量組與卡托普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

2.3甘草酸對(duì)心肌梗死大鼠組織形態(tài)學(xué)的改善 HE染色顯示，假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞及肌原纖維均排列有序。模型組心肌細(xì)胞發(fā)生大量變性、壞死，肌原纖維斷裂，部分排列紊亂，組織伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。甘草酸各劑量組及卡托普利組破裂、壞死心肌細(xì)胞數(shù)量有所減少，肌原纖維斷裂減少，心肌損傷程度得到一定的緩解。見圖2。

2.4甘草酸對(duì)心肌梗死大鼠TNF-α和MCP-1水平 與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α和MCP-1水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草酸各劑量組、卡托普利組TNF-α和MCP-1水平明顯降低(均P<0.05)；隨著甘草酸劑量的增加，甘草酸各劑量組TNF-α和MCP-1水平逐漸降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。甘草酸高劑量組與卡托普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

A：假手術(shù)組，B：模型組，C：甘草酸低劑量組，D：甘草酸中劑量組，E：甘草酸高劑量組，F(xiàn)：卡托普利組，圖3同圖1 TTC染色觀察大鼠心肌梗死面積比例變化情況

圖2 HE染色觀察心肌梗死大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化情況(200×)

表2 各組血清中TNF-α、MCP-1水平比較

2.5甘草酸對(duì)心肌梗死大鼠JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織中p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白水平明顯降低，HMGB-1、Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)明顯升高(均P<0.05)。與模型組相比，甘草酸各劑量組、卡托普利組p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白水平明顯升高，HMGB-1、Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；隨著甘草酸劑量的增加，甘草酸各劑量組p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白水平逐漸升高，HMGB-1、Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)逐漸降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。甘草酸高劑量組與卡托普利組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3，圖3。

表3 各組心肌組織中JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表達(dá)比較

圖3 Western印跡法檢測(cè)心肌組織中JAK/STAT、Wnt3a通路蛋白表達(dá)

3 討 論

本研究提示心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞受損，組織出現(xiàn)炎癥損傷。心肌缺血發(fā)生后引發(fā)的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，造成左心室重構(gòu)和心衰〔9〕。本研究表明心肌梗死大鼠心肌舒縮功能受損，推測(cè)心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞壞死，引起心肌炎癥損傷，引發(fā)心功能失調(diào)，提示心肌梗死大鼠模型建立成功。

甘草酸別名甘草甜酸，屬于甘草中重要的活性物質(zhì)之一，具有抗病毒、抗免疫、抗炎的生物活性。近期研究發(fā)現(xiàn)甘草酸也可作為HMGB-1的抑制劑，通過抑制HMGB-1活性進(jìn)而發(fā)揮炎癥反應(yīng)，Shafik等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)甘草酸可通過抑制HMGB-1活性改善關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)。Yan等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷大鼠中經(jīng)甘草酸處理后能夠明顯縮小梗死體積，改善神經(jīng)功能損傷，其可能是通過抑制MGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)甘草酸可能通過抑制HMGB-1活性來抑制心肌梗死大鼠心肌炎癥損傷，發(fā)揮對(duì)心肌組織的保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)一直存在于心肌缺血的整個(gè)過程，早期炎癥反應(yīng)標(biāo)志為血清中炎癥因子及趨化因子水平顯著升高，進(jìn)而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，加重心肌缺血性損傷。MCP-1屬于常見趨化因子，可通過招募心肌組織炎性細(xì)胞至炎癥部位，引發(fā)炎癥反應(yīng)〔12〕。TNF-α屬于重要的炎癥因子，在心肌梗死心肌組織中高表達(dá)，可造成心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥大及心室重構(gòu)〔13〕。本研究推測(cè)甘草酸可能通過降低心肌梗死大鼠炎癥相關(guān)因子表達(dá)，緩解心肌組織炎癥損傷，發(fā)揮對(duì)心肌梗死大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

JAK/STAT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用。JAK/STAT家族中包含多個(gè)成員，而JAK2、STAT3與心肌損傷關(guān)系最為密切。Abdelsamia等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)采用JAK抑制劑預(yù)處理心肌缺血損傷模型大鼠后，心肌組織中JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，進(jìn)而緩解心肌炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)心肌組織的保護(hù)。李紅霞等〔15〕發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá)明顯降低，而經(jīng)丹參酮ⅡA處理后，心肌組織中JAK2/STAT3通路蛋白表達(dá)明顯升高，心肌炎癥損傷得到緩解。本研究結(jié)果推測(cè)甘草酸可能通過激活JAK/STAT信號(hào)通緩解心肌炎癥損傷。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路與心臟的發(fā)育有關(guān)，參與心血管相關(guān)疾病的發(fā)生〔16,17〕。過往研究顯示在心臟發(fā)育早期，Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化對(duì)心肌細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用；而在成人心肌組織中，正常生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于關(guān)閉狀態(tài)，而在心肌缺血、心力衰竭、冠心病等心臟疾病組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于異常激活狀態(tài)〔18〕。Li等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)miR-34a通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)大鼠心肌梗死后細(xì)胞凋亡。Qiu等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路減輕H2O2誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果推測(cè)甘草酸可能通過抑制Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路緩解心肌炎癥損傷。