微生物檢驗研究進展與發展趨勢

王偉麗

（桂林三金藥業股份有限公司，廣西 桂林 541199）

在諸多領域的工作中都涉及微生物檢驗環節，如食品、藥品等的檢驗，對保障相關產品的質量具有重要作用。微生物檢驗也是實驗室檢測的重要手段，根據檢測需要和實際情況采取相應的微生物檢驗手段能更好地提升微生物檢驗效果與水平，這就需要相關人員不斷深入研究微生物檢驗技術，把握好微生物檢驗的發展趨勢，使其在相關工作中得到更好的應用。

1 微生物檢驗技術概述

微生物檢驗主要是對部分產品（一般是口服的食品、藥品）中的微生物污染開展定性或者定量檢驗的技術。該技術涉及諸多領域與行業，如食品、飲用水、外用或口服的藥品、需滅菌的產品和化妝品等，此類產品衛生標準有明確的規定，通過微生物檢驗技術對其微生物污染實現嚴格控制，避免各類有害病原微生物侵入人體而對廣大消費者的健康造成危害。在微生物的常規檢驗中，主要的測定內容有需氧菌的總數、霉菌的總數、腸道的致病菌、化膿性的致病菌、食物的中毒菌、破傷風的厭氧菌、活螨蟲和螨蟲卵以及大腸菌群等。在微生物檢驗中，一定要嚴格執行檢驗的程序，在樣品檢驗前一定要對操作的環境提前采取滅菌處理，操作期間謹防出現二次污染[1]。

在微生物檢驗中，基本操作有接種、分離純化、培養、鑒定和保存等。在接種方面，常用的方法有劃線接種、三點接種、穿刺接種、澆混接種、涂布接種、液體接種、注射接種、活體接種等。對培養基完成高壓滅菌后，通過已滅菌處理的工具在無菌條件下進行含菌材料向培養基上接種。在分離純化方面，若一個菌落內的所有細胞都來自一個親代細胞，此菌落就被稱作純培養。在鑒定菌種時，用到的微生物要求是純培養物，而純培養物的獲取就是分離純化的過程，方法也有很多，如傾注平板、涂布平板、平板劃線、富集培養、厭氧處理、單細胞分離等。在培養方面，以培養時對氧氣的需求情況為標準，可以分為好氧培養、厭氧培養；以培養基的物理狀態為標準，可以分為固體培養、液體培養。在鑒定方面，主要涉及形態學的觀察、生理生化的試驗、化學成分的分析、基因型的分析、系統發育的分析等內容。在保存方面，基本原理是挑選優良的純培養物，使其處于休眠狀態，然后人為創造有利于其休眠的環境，使其在長期保存后依然具備菌種原有的優良特性[2]。比較常用的方法有定期移植方法、液體石蠟方法、真空冷凍干燥法、低溫凍結方法等。

2 基因檢測在微生物鑒定中的應用進展

在微生物鑒定中，基因檢測是一種新技術，目前已經研究出下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），此方法主要是對大量DNA的小片段進行檢測，通過特定算法對個體檢測的數據與參考基因的序列實施對比，發現可能存在的變異情況。以醫學臨床中的微生物檢驗為例，NGS可以用于感染性疾病病原體的鑒定。對病原微生物的傳統鑒定方法主要包括涂片鏡檢處理、分離培養、質譜和生化反應等，但此類方法呈現出周期長、靈敏度低和過程復雜等缺點，對分枝桿菌的菌種鑒定用時需30～40 d，對苛養菌、病毒等的培養條件也極為苛刻，大大增加了培養的難度。分子診斷基于聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）有效解決了上述病原體的鑒定問題，但不能解決未知的微生物檢驗難題，因為未知的微生物核酸序列也未知，無法設計引物，這也成為該技術最大的難題[3]。在NGS檢測中，不需要對病原體實施分離培養處理，也不依賴已知的核酸序列，能直接實現標本的測序、鑒別，有效節省了檢測時間、提升了診斷效率，在對未知物種和難培養病原體的鑒定中具有顯著的優勢。在對病原體的鑒定中，NGS的應用主要包括兩種方法，分別是rRNA基因測序、全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）。其中，rRNA基因測序法在臨床上主要用于細菌和真菌等鑒定，也是菌群分析環節的基礎；WGS和rRNA基因測序方法相比，WGS能獲取更加全面的信息，適合在病毒的鑒定中使用。大部分的病毒是不可培養的，且存在高度變異的情況，NGS和基因芯片、Sanger測序法等相比，NGS具有更高的效率，也不需要設計特定探針，適用于復雜的臨床標本病毒鑒定。

3 微生物鑒定技術的研究進展

微生物鑒定的定義是以現有的分類系統對未知微生物的特征實施測定，以對其實施細菌、霉菌和酵母菌等大類區分，或對屬、種和菌株水平進行確定的過程。在鑒定污染微生物時，一般結合鑒定的水平合理選擇鑒定的方法。在微生物的鑒定中，傳統方法（經典的生化反應、革蘭氏染色的顯微鏡鑒別等）一般適用于大多數非無菌類藥品的生產以及部分無菌生產環境中的風險評估。但在藥品的微生物污染相關事件中，通過傳統的方法并不能滿足快速分型、準確鑒定和溯源分析等需求，所以，研究分子生物學時產生的基因型鑒定法逐漸得到應用[4]。

采用傳統技術鑒定表型主要包括菌落形態的觀察、染色、生化鑒定、顯微鏡檢查等環節，呈現出成本低和便于操作等優點。但微生物表型存在一定的可變性，不同的生長環境會對其表觀形態產生影響，如不同培養基內的微生物可能有不同的顏色。同時，傳統表型鑒定技術對人員經驗和培養條件較為依賴，在一些生長緩慢、培養難度大、需特殊營養的微生物鑒定中具有很大的局限性。隨著社會的發展，現代化的微生物鑒定技術逐漸在藥品污染的微生物鑒定、溯源分析以及污染調查等方面得到廣泛運用，此類技術實現了對傳統表型鑒定的拓展與豐富，如生化鑒定系統（如ⅤITEK和API的系統）、FTIR（傅里葉紅外光譜）、MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜）、以碳源分析為基礎的全自動化微生物鑒定系統、脂肪酸鑒定系統等，有效提升了微生物的鑒定效率和藥品質量的控制水平。

隨著鑒定技術的發展，基因型鑒定技術被研發出來，這是一種以微生物的基因序列為基礎，對其分子實施生物學鑒定的技術，不依賴微生物的培養，是一種現代化的鑒定技術類型?；蛐丸b定技術和表型鑒定技術存在很大不同，其數據庫較為完善，能以微生物的遺傳物質為基礎，通過差異分析對微生物進行鑒定，呈現出高效率、高準確度和高通量等特點。在自然環境中，約有10%的物種能以分離培養的方法獲取，以微生物的培養為基礎的傳統表型鑒定具有很大的應用局限性，而采用基因型鑒定，以16S rRNA的高通量式測序法獲取的微生物群落信息就十分全面。當然，基因型鑒定也有一定的缺陷，使用16S rRNA法時，不能對某些親緣較近、不明顯的特征序列類微生物進行準確鑒定；采用高通量的測序分析混合樣本時，不能有效排除已死亡的微生物干擾因素等[5]。

4 微生物檢驗技術的發展趨勢

在微生物檢驗技術的發展過程中，逐漸產生了很多技術類型，各有優缺點。為了有效地彌補各檢驗方式的缺陷，可以對多種方式實現聯合運用。在選擇檢驗方式時，需要綜合考慮相應條件，特別是檢驗中對靈敏度的要求。因此，提升靈敏度、消除假陽性是檢驗技術研究過程中的重要關注內容。在計算機技術迅速發展的背景下，微生物檢驗技術朝著高度自動化以及簡便快速的方向發展。目前，分子生物學相關技術在自動化的儀器聯合中，已經被運用于病原菌的診斷和鑒定、耐藥基因的檢測等方面。要想實現高質、高效和價格低廉等有效統一，就要改變臨床中病原菌的檢驗現狀以及傳統觀念，在各學科的交叉發展中，新型檢驗技術也會越來越多。

近年來，新型技術得到了迅速發展，如電化學和比濁法等技術，可以對藥品內的活微生物實現直接測定；固相細胞的計數法以及流式細胞的計數法等，能分析微生物細胞內的特定成分。上述技術能提高藥品檢測的準確性，也能保證檢測人員的安全，因此，應用前景十分廣闊?；诩夹g的迅速發展，要想實現藥品中微生物檢驗的進步，還要完善檢驗標準，提升相關檢驗人員的綜合素質和專業水平。因為藥品檢驗期間需要人工操作，操作人員的技術水平會對檢測結果產生直接影響。為了提升操作人員的技術水平，要對檢測人員開展定期培訓。目前，在藥品微生物的檢驗中，軟硬件設備都得到了顯著改善，且藥品的微生物檢驗技術也朝著標準化方向發展，特別是對無菌制劑的研究已取得顯著成就，推動著檢驗項目和方法、藥典制定的依據等朝著更科學的方向發展[6]。

5 結語

微生物的檢驗在諸多領域得到了應用，也逐漸產生了很多檢驗技術和方法，各有優點與不足。為了促進相關技術作用的充分發揮，還需要對檢驗技術不斷進行研究，把握好檢驗技術的發展趨勢，推動檢驗技術的現代化發展。