不同大孔樹脂苦蕎黃酮富集品中4種主要黃酮的定量檢測

李姝 ，王松濤，吳萌萌，邵華武，趙建，焦威*

1. 中國科學院成都生物研究所（成都 610041）；2. 瀘州品創科技有限公司（瀘州 646000）；3. 四川大學生命科學學院資源微生物學及生物技術教育部重點實驗室（成都 610064）

苦蕎麥俗稱苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.），學名韃靼蕎麥，屬雙子葉蓼科蕎麥屬[1]。苦蕎在我國種植歷史悠久，其味苦、性平寒，具有活氣血、續精神、實腸胃等功效，是少有的亦食亦藥糧食作物[2]。我國是苦蕎的發源地，也是苦蕎的主產國之一，苦蕎在我國的山西、內蒙古、陜西、江西、云南、貴州、四川等地均有分布，特別是在西南地區有大面積種植[3]。近年來已有研究表明，黃酮類物質是苦蕎中最重要的生物活性物質，其具有降三高、抑菌、抗炎、抗氧化、抗癌、緩解動脈粥樣硬化、預防老年癡呆等多種生理功能[4-10]。

苦蕎中的活性黃酮類化合物主要包含蘆丁、槲皮素和山柰酚等[11-12]。苦蕎種子不同部位黃酮類化合物含量差異較大，其中以苦蕎麩皮中黃酮類化合物的含量最高，是苦蕎類食品加工中具有利用價值的副產物[13-14]。王軍[15]研究發現采用乙醇熱回流法、微波輔助法、超聲波輔助法分別提取苦蕎麩皮總黃酮，得率均在5%～6%之間。由于僅采用溶劑提取法獲得的提取物中黃酮含量較低，效率較差，為獲得較高含量的苦蕎麩皮黃酮富集品，進一步純化加工顯得尤為重要。鑒于食品安全生產對于溶劑、方法的限制，黃酮類物質的精制方法主要包括沉淀法、逆流色譜法、層析法、大孔樹脂法等。其中，大孔樹脂法以其價格低廉、吸附容量大、可反復使用、可應用于食品、藥品生產等優點成為實驗室以及規模化生產中最常用有效的純化方法[16]。而HPLC法以其分離效果好、分析時間短、樣品量少等特點成為最適用于黃酮類物質檢測的方法[17]。目前，利用HPLC法同時測定經不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮精提物中多種黃酮成分的文獻尚未見報道。

此次試驗擬通過3種大孔樹脂純化獲得苦蕎麩皮黃酮富集品，并采用HPLC建立同時測定苦蕎麩皮富集品中4種黃酮類物質的分析方法，用于黃酮類成分的含量測定，以期為苦蕎提取物的食品生產利用及質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-16型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHZ-DIII循環水式多用真空泵（鞏義市科華儀器設備有限公司）；YRE-301旋轉蒸發器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；HZK-FA210萬分之一電子分析天平（福州華志科學儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州匯成科工貿有限公司）；PCWJ-10超純水系統（成都品成科技有限公司）；凈品級ADS-7、AB-8、D101型大孔吸附樹脂（天津浩聚樹脂科技有限公司）。

乙醇（純度≥95%，食品級，成都市科隆化學品有限公司）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（色譜純），Knowles；蘆丁（純度≥99%）、煙花苷（純度≥98%）、槲皮素（純度≥99%）、山柰酚標準品（純度≥98%），成都普思生物科技股份有限公司；苦蕎麩皮原料（四川環太生物科技股份有限公司）。

1.2 色譜分析條件

采用Intersustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈和0.2%磷酸水溶液分別作為流動相A和B。梯度洗脫程序：0～25 min，15%～25% A；25～35 min，25%～50% A；35～45 min，50%～90% A；45～55 min，90% A。進樣量20 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長360 nm。

1.3 混合標準品溶液的制備

分別精密稱取10 mg蘆丁、2 mg煙花苷、5 mg槲皮素和1 mg山柰酚，用甲醇充分溶解后分別定容于10 mL容量瓶中，制成質量濃度分別1，0.2，0.5和0.1 mg/mL的標準樣品母液。分別準確量取4，1，3和1 mL上述標準樣品母液于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，備用。

1.4 大孔樹脂富集苦蕎麩皮黃酮

取適量苦蕎麩皮，以料液比1∶10（g/mL），加入70%乙醇，在60 ℃下熱回流提取3 h，提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，得苦蕎麩皮黃酮粗品。

取上述苦蕎麩皮黃酮粗品，加水制備成1 mg/mL的上樣液，以90%乙醇、2 BV/h的洗脫速度，采用ADS-7、AB-8、D101型大孔吸附樹脂分別對苦蕎麩皮黃酮粗品進行洗脫純化，收集6 BV洗脫液，減壓濃縮至干，得到不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品。

1.5 待測樣品溶液的制備

分別精密稱取10 mg不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品，用甲醇充分溶解，定容于10 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2 結果與討論

2.1 標準品和待測樣品色譜圖

取各標準品混合液，分別在200～500 nm范圍內進行紫外-可見光光譜掃描，分析4種黃酮類物質的最大吸收光譜。4種黃酮類物質在256和360 nm左右有最大吸收峰，同時考慮到標準品在256 nm處基線不穩定，而在360 nm處基線穩定，因此選擇360 nm作為黃酮類化合物的檢測波長（圖1）。按1.2小節條件，分別精密吸取20 μL混合標準品、ADS-7、AB-8、D101型大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品溶液進樣，結果顯示，以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，可以很好地將目標峰分開，各相鄰色譜峰之間的理論塔板數均大于30 000，分離度均大于1.5（圖2）。

2.2 檢測方法學考察

2.2.1 線性關系

將混合標準品溶液加入甲醇稀釋，分別配制成5個質量濃度水平。按1.2小節條件進樣，以相應標準品的質量濃度為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，分別得到蘆丁、煙花苷、槲皮素、山柰酚的回歸方程、相關系數和線性范圍，結果見表1和圖3。

結果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚分別在25～400，1.25～20，9.375～150和0.625～10 μg/mL的濃度范圍內與峰面積線性關系良好，線性相關系數均在0.999 6及以上。

圖1 標準品紫外吸收圖

圖2 混合標準品（A）和ADS-7（B）、AB-8（C）、D101（D）富集的待測樣品色譜圖

表1 4種黃酮類成分的線性關系

圖3 4種黃酮類成分的標準曲線

2.2.2 精密度試驗

取20 μL混合標準品溶液，按1.2小節重復進樣6次，記錄各黃酮成分的峰面積。結果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚峰面積的δRSD分別為1.3%，1.7%，1.7%和0.9%，表明儀器精密度較好。

2.2.3 穩定性試驗

將制備的同一份樣品溶液，分別于配制后的0，2，4，8，12，24和48 h進樣20 μL，記錄各組分的峰面積。結果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚峰面積的δRSD分別為2.4%，2.8%，1.6%和2.8%，表明待測樣品溶液中4種黃酮類物質在48 h內穩定。

2.2.4 重復性試驗

取5份適量苦蕎麩皮黃酮富集品，按1.5小節方法制備待測樣品溶液。精密吸取20 μL待測樣品溶液，按1.2小節依次進樣，結果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚含量的δRSD分別為3.5%，3.3%，3.3%和3.2%，表明方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的苦蕎麩皮黃酮富集品，分別加入一定量的蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚儲備液，其加入的量約相當于樣品量的100%，每份樣品重復6次。按1.2小節條件進樣，結果顯示，蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚的平均回收率分別為99.48%，100.86%，100.93%和102.27%，符合分析要求。δRSD分別為3.2%，3.2%，3.0%和1.7%，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.3 不同大孔樹脂富集樣品檢測結果

分別取不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品，制備待測樣品溶液，按1.2小節條件進樣，并分析4種黃酮類化合物的含量，結果如表3所示。不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚4種黃酮類化合物的總含量由高到低為ADS-7型大孔樹脂＞AB-8型大孔樹脂＞D101型大孔樹脂。

表3 不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮富集品檢測結果

3 結論

此次試驗建立了高效液相色譜同時檢測不同大孔樹脂富集的苦蕎麩皮黃酮樣品中蘆丁、煙花苷、槲皮素和山柰酚4種黃酮類成分的含量檢測方法，結果發現，ADS-7型大孔樹脂富集的苦蕎麩皮中4種黃酮的總含量相較AB-8和D101型大孔樹脂更高，且該方法操作簡單、準確性高、重復性好，可作為不同大孔樹脂富集苦蕎麩皮黃酮類物質的檢測方法。該方法為相關產品開發的質量控制和進一步研究提供了參考。