響應面法優化纖維素酶對麥芽-麥胚芽發酵酒的澄清效果

王 凱，黃 鈺，程 浩，武紀天，李 楠

(廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530004)

麥芽別稱穬麥蘗（《名醫別錄》），《名醫別錄》“麥穬”條云：“作蘗，溫，消食和中?！庇眠m量水浸泡麥粒，使其處于適宜的濕度和溫度，幼芽長到約0.5 cm，干燥即可制得麥芽。麥芽味道甘甜，其性偏暖，具有潤氣消食、健脾歸中等功效，長期服用可對脾虛食少者身體恢復產生良好效果[1-2]。

小麥胚芽是面粉加工的副產品，大多數在生產過程中廢棄，得不到有效利用。小麥胚芽可用作飼料，其含有多種營養素(如優質蛋白、脂肪、維生素、礦物質等)，還有多種生理活性物質(如麥胚凝集素、谷胱甘肽、黃酮類物質、二十八烷醇等)[3]。目前研究表明，小麥胚芽已被較多用于食品方面的研究，例如生產飲料[4]、制作新品納豆[5]、保護熟魚片油穩定性[6]等。

纖維素酶由于可以分解纖維素，在生物醫藥、食品研發、造紙行業等領域中受到廣泛使用。程浩等[7]以桂林月柿為原料發酵釀造柿子醋,在澄清過程中添加纖維素酶，澄清效果良好。陳智理等[8]通過單因素和正交試驗,對纖維素酶和果膠酶酶解處理香蕉果酒的得率和澄清度進行試驗，在最優條件組合下酶解后香蕉果酒的得率和透光率的綜合評價指標為91.1%。BARBOSA K L等[9]分離、篩選和部分鑒定甘蔗螟蟲腸道中存在的細菌纖維素酶，以期將纖維素酶作為一種醫用抑制劑。目前關于纖維素酶對于麥芽-麥胚芽酒的澄清研究尚未報道，本試驗以萌發麥芽以及小麥胚芽為原料釀造麥芽-麥胚芽酒，加入纖維素酶進行澄清，在單因素實驗基礎上，以澄清時間、澄清溫度、纖維素酶添加量為自變量，透光率為響應值，通過響應面法優化麥芽-麥胚芽酒澄清工藝，以獲得澄清的發酵酒，為麥芽和小麥胚芽應用于工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

麥芽與麥胚芽，市售；麥芽-麥胚芽酒，本實驗室發酵自制；釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司。

儀器與設備：恒溫水浴鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；SN510C 全自動高壓滅菌鍋，重慶雅瑪拓科技有限公司；SHP-250 生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；JJ-2 組織搗碎機，常州迅生儀器有限公司；YP201N電子天平，上海菁華科技儀器有限公司；PL-303 分析天平，METTLER TOLEDO 有限公司；UVmini-1240 紫外-可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥芽-麥胚芽酒的釀造工藝

麥芽精選→組織搗碎機粉碎→加入麥胚芽（麥芽與麥胚芽質量比2.5∶1）→加水混勻（料液體積比1∶3）→65 ℃糖化→取上清液→高溫滅菌→接種→28 ℃發酵7 d（酵母活化）→酒渣分離→澄清過濾→原酒→殺菌灌裝→成品

1.2.2 單因素澄清實驗

澄清時間對澄清效果的影響：將纖維素酶按照400 mg/L 質量濃度加入到麥芽-麥胚芽發酵酒中，充分搖勻，45 ℃水浴條件下分別澄清0、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h 后取出，室溫靜置2 d 后離心取上清液在波長750 nm下測定透光率[10]。

澄清溫度對澄清效果的影響：將纖維素酶按照400 mg/L 質量濃度加入到麥芽-麥胚芽發酵酒中，充分搖勻，分別設置溫度為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃的水浴條件，澄清6 h 后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

纖維素酶添加量對澄清效果的影響：將纖維素酶按照0、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L 質量濃度加入到麥芽-麥胚芽發酵酒中，充分搖勻，45 ℃水浴條件下澄清6 h 后取出，室溫靜置2 d后按上述方法測定透光率。

1.2.3 響應面試驗設計優化澄清工藝

根據單因素實驗所得數據，采用響應面方法優化澄清工藝，以澄清時間（A）、澄清溫度（B）、纖維素酶添加量（C）3個因素為自變量，以透光率（Y）為響應值，根據Box-Benhnken 試驗設計原理，設計3因素3 水平試驗進行優化，進行響應面分析，并驗證結果的可靠程度。響應面因素與水平見表1。

表1 澄清工藝優化Box-Benhnken試驗設計因素與水平

1.2.4 數據處理與分析

單因素實驗過程中取3 次平行進行測定，所得數據通過Origin2017 版繪圖軟件進行展示。響應面法采用Design-Expert V8.0.6軟件進行設計，并進行數據分析。采用SPSS21.0 統計軟件進行方差分析和顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 發酵酒澄清工藝優化單因素實驗

2.1.1 澄清時間對澄清效果的影響（圖1）

圖1 時間與澄清效果的關系

由圖1 可知，發酵酒的透光率隨著澄清時間的延長先增高后下降，在0～6 h澄清時間范圍內逐漸增大，在6～15 h 澄清時間范圍內逐漸下降。出現先增大后下降的原因是由于澄清時間過短，酶作用時間不夠充裕，在較短的時間內不能澄清酒體中的纖維素類物質；若澄清時間過長，已經絮凝的物質會重新溶解到體系中，導致透光率的下降。透光率在澄清時間為6 h 時達到最大，可達87.4%，因此采用澄清時間為6 h進行澄清。

2.1.2 澄清溫度對澄清效果的影響（圖2）

圖2 溫度與澄清效果的關系

由圖2 可知，隨著溫度的升高，透光率呈現出先增大后下降的趨勢，在30～45 ℃澄清溫度范圍內逐漸增大，在45～55 ℃澄清溫度范圍內逐漸下降。導致透光率呈現上述變化趨勢的原因是，在較低溫度條件下，酶達不到比較適宜的溫度，其澄清效果欠佳，對于酒體中大分子物質澄清不徹底；在較高溫度條件下，由于溫度較高，超過了酶作用的最適溫度，酶活下降，并且較高的溫度酒體分子熱運動也更為明顯，從而導致酒體透光率下降。透光率在澄清溫度為45 ℃時達到最大，可達87.8%，因此采用澄清溫度為45 ℃進行澄清。

2.1.3 纖維素酶添加量對澄清效果的影響（圖3）

圖3 纖維素酶添加量與澄清效果的關系

由圖3 可知，隨著纖維素酶添加量的逐漸增多，透光率的變化趨勢為先增大后下降。在0～400 mg/L 纖維素酶添加量范圍內，透光率隨著添加量的增多而增大，在400～700 mg/L 纖維素酶添加量范圍內，透光率隨著添加量的增多而下降。造成這種現象產生的原因是，在酶添加量較低的范圍內，酶的總量能使酒體達到較好的澄清效果；當酶添加量達到較高范圍時，過量的澄清劑使得酒體中更易產生二次渾濁，從而影響穩定性，進而導致酒體透光率的下降。透光率在纖維素酶添加量為400 mg/L 時達到最大，可達88.7 %，因此采用纖維素酶添加量400 mg/L進行澄清。

2.2 發酵酒澄清工藝響應面優化

2.2.1 響應面模型的建立及分析

在單因素實驗所得數據的基礎上，進行Box-Benhnken 試驗設計，以澄清時間（A）、澄清溫度（B）、纖維素酶添加量（C）3 個因素為自變量，以透光率（Y）為響應值，應用Design-Expert V8.0.6 軟件對試驗所得數據進行回歸擬合及分析。響應面優化試驗方案及結果見表2，模型分析見表3。

利用軟件對試驗數據進行回歸擬合，所得自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程如下：

由表3可知，模型P值=0.0001＜0.01，達到極顯著水平，說明響應面試驗所得模型可靠，擬合性良好，可用于后續優化；失擬項P 值=0.2955＞0.05，顯著水平為不顯著，表明方程擬合良好，未出現失擬現象，試驗方法可靠性高；因素A、C 的P 值均小于0.01，說明澄清時間與纖維素酶添加量對麥芽-麥胚芽酒的澄清效果影響是極顯著的，而因素B 的P值=0.0151＜0.05，表明澄清溫度對麥芽-麥胚芽酒澄清效果影響是顯著的；交互項AB 的P 值=0.0145＜0.05，說明此交互項AB對酒體澄清效果具有顯著影響，而交互項AC、BC 的P 值均大于0.05，說明交互項AC、BC 對酒體澄清未達到顯著影響；A2、B2、C2均小于0.01，表明A2、B2、C2對酒體澄清效果影響極顯著。由F 值可知因素C＞A＞B，表明所選取的3 個因素對酒體澄清效果的影響順序為：纖維素酶添加量＞澄清時間＞澄清溫度。

表2 響應面試驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析結果

表4 方差相關系數

由表4 可知，擬合度R2=0.9727，校正擬合度R2Adj=0.9376，兩者數值較接近，表明所建立的模型與實際試驗擬合性良好，準確性高；預測擬合度R2Pred=0.7340，表明模型預測性良好；變異系數CV（%）=1.22＜5.0%，表明方程的可重現性良好[11]；信噪比=13.857＞4.0，表明試驗精密度高，模型可信度高。綜上所述，可利用此模型進行分析各因素變化對響應值的影響，并預測其變化規律。

2.2.2 各影響因素交互作用分析（圖4）

由圖4A 可知，在纖維素酶添加量一定時，隨著澄清時間的延長與澄清溫度的升高，透光率呈現出先增大后下降的趨勢，且等高線圖呈現為明顯的橢圓形。兩種因素在較低范圍內增加時，透光率逐漸增大；當兩種因素增加到較高范圍時，又會導致透光率的降低。這表明交互項AB對透光率的影響是顯著的。

由圖4B 可知，在澄清溫度一定時，隨著澄清時間的延長與纖維素酶添加量的增加，透光率呈現出先增長后下降的趨勢，等高線圖呈現為較接近圓形，顯著性不明顯[12]。這表明交互項AC 對透光率的影響不顯著。

由圖4C 可知，在澄清時間一定時，隨著澄清溫度的升高與纖維素酶添加量的增加，透光率呈現出先上升后降低的趨勢，等高線圖雖為較明顯的橢圓形，但其等高線圖較疏松，表明爬坡較緩，顯著性不明顯。這表明交互項BC對透光率的影響不顯著。

2.2.3 澄清效果驗證性實驗（圖5）

圖4 因素交互作用對麥芽-麥胚芽酒澄清度影響的響應曲面和等高線

通過Design-Expert V8.0.6 軟件所得到的回歸模型，預測的麥芽-麥胚芽酒澄清條件理論最佳值為：澄清時間6.75 h，澄清溫度46.39 ℃，纖維素酶添加量468.62 mg/L；預測最佳透光率為90.7374%，其可行性達到0.581。按照實際條件操作的可行性進行模擬，選取實驗條件為澄清時間7 h，澄清溫度46.4 ℃，纖維素酶添加量470 mg/L 進行驗證實驗，得到實際麥芽-麥胚芽酒的透光率為90.2 %，與理論預測值90.7374 %相差較小，可以采用。綜上所述，基于響應曲面法所得的優化澄清工藝參數準確可靠，得到的工藝條件具有實際操作性。

3 結論

本試驗通過單因素實驗選取最優條件值，利用Design-Expert V8.0.6 軟件進行Box-Benhnken 試驗設計，以澄清時間、澄清溫度、纖維素酶添加量為自變量，麥芽-麥胚芽酒的透光率為響應值，對試驗數據進行回歸擬合，所得自變量與透光率（Y）的二次多項回歸方程為：Y=89.22+1.74A+1.18B+3.31C-1.68AB+1.15AC+0.43BC-4.11A2-1.89B2-2.71C2，并確定麥芽-麥胚芽酒最佳澄清條件為：澄清時間7 h，澄清溫度46.4 ℃，纖維素酶添加量470 mg/L，得到酒體透光率為90.2%，為纖維素酶規?；糜诰祁惓吻寮胞溠颗c麥胚芽工業化應用提供參考。

圖5 預測條件的可行性