RNAi技術在昆蟲防控研究中的應用和發展前景

李晨雨，裴新國，張伊杰，高聰芬

（南京農業大學植物保護學院，綠色農藥創制與應用技術國家地方聯合工程研究中心，南京 210095）

從基因角度對害蟲進行防控是一種新視角，其可以解決一些殺蟲劑所無法觸及的問題。CRISPR-Cas9作為第3代基因編輯技術，是當今生命科學研究領域的熱點，但它仍處于高度實驗的階段，使用價格高且還有許多未知的風險。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術作為一種存在于真核細胞中的基因調控機制，能引發特定基因的轉錄后沉默，具有特異性、高效性、位置效應、ATP依賴性和可傳播性等特點[1]，在病蟲害防治中展現出巨大的潛力，且因其不易與其他殺蟲劑產生交互抗性，因此成為一種新興的害蟲防控策略[2-3]。

關于RNAi最早的報道是1990年Napoli等[4]在牽牛花中發現的共抑制現象。他通過注射植物花色的相關基因到牽牛花中，使原本鮮艷的花色變得白皙；比較基因的表達含量時發現，轉基因花比正常花濃度低了50倍，原因在于導入的基因和內源基因表達均被抑制，且該抑制是發生在轉錄后，故又稱為轉錄后基因沉默。Fire等[5]于1998年首先證實了RNAi現象，通過向秀麗隱桿線蟲中注射dsRNA后發現，其對基因有極高的抑制作用，揭示了基因沉默的本質，即dsRNA能有效地降低目標基因的表達活性，并將這一現象命名為RNAi。目前，隨著RNAi技術的日趨成熟，越來越多的試驗證實RNAi現象幾乎在所有真核生物中都有發現，包括原生動物、無脊椎動物、脊椎動物、真菌、藻類和植物[6-7]。美國國家醫學圖書館（PubMed）上以“insect”和“RNAi”作為關鍵詞搜索發現，2000年以來昆蟲RNAi研究領域共有4580個相關的報道數據結果，近10年來所發表文章數約占數據結果的75%，總體呈逐年增多的趨勢，說明針對該研究領域進行昆蟲的防控和相應靶標藥劑的研發正在快速發展，且越來越受到人們的重視。

筆者主要論述RNAi技術在昆蟲防控研究中的應用和發展前景，從RNAi技術的原理、導入方法、效率及其在農業害蟲中的應用研究實例等4個方面進行了綜述，旨在介紹其潛在的害蟲防治應用前景。

1 RNAi的原理

RNAi存在于真核生物中，是一種強大的基因功能研究技術。RNAi的作用過程大致可分為3個階段，分別是起始階段、效應階段和擴增階段[8]。

起始階段：來自內源或體外合成的dsRNA被轉移進入宿主細胞內與細胞內Dicer酶作用后，被剪切成21～25 bp的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）。

效應階段：siRNA在宿主細胞中被細胞內解旋酶解旋成兩條單鏈，其反義鏈（引導鏈）在細胞質內結合一個核酶復合物，形成RNA誘導的沉默復合物，通過堿基互補配對原則特異性識別細胞內信使RNA（mRNA），由核酸內切酶將靶標mRNA降解，使該mRNA表達量下降，從而促使靶標基因沉默，細胞內該基因功能喪失[9]。

擴增階段：又稱信號級聯放大階段，即siRNA與靶序列mRNA結合后，以siRNA作為引物，RNA聚合酶催化合成新的dsRNA模板，之后重復前兩個階段，使RNA沉默作用不斷放大。

2 RNAi在昆蟲體內的導入方法

如何將dsRNA導入昆蟲體內在很大程度上影響著昆蟲RNAi的效果，同時在有害生物的防控應用中也是極其關鍵的一環。目前，RNAi導入的主要方法有注射、浸泡、飼喂，以及在此基礎上衍生出來的轉基因植物介導、納米粒子包被、脂質體修飾、病毒感染、共生體介導等。

注射法是目前研究昆蟲基因功能最常用的方法。該方法將dsRNA或siRNA在適當的溶液中通過注射針插入昆蟲的胚胎或蟲體的特定部位，避開腸道直接到達血淋巴和相應組織，可實現快速準確到達作用部位，避開結構障礙。由于注射條件的限制，該方法目前只能應用于室內昆蟲基因功能研究，無法大規模應用于田間害蟲防治。

浸泡法，也稱為細胞外RNAi，一般是針對昆蟲細胞株，將昆蟲細胞直接浸泡在dsRNA的溶液里，誘導產生RNAi現象。該方法在適宜的培養液濃度、溫度、時間等前提條件下，具有轉染速度快、周期短的優點。

飼喂法是給昆蟲飼喂含有人工合成或微生物體內合成dsRNA的食物，通過口器取食進入蟲體的一種導入方法。與注射法相比，該方法沒有機械損傷，實際應用更方便，已在鞘翅目昆蟲中取得較好效果，可用于高通量靶標基因篩選和大田推廣[10]，但在鱗翅目昆蟲中效果差。昆蟲體內的RNAi現象存在劑量限制，需要不斷地飼喂dsRNA才能使之產生持續RNAi現象，因此需要對劑量濃度和飼喂時間進行把控。有研究[11]報道，針對亞洲柑橘木虱，通過將2種及2種以上針對不同靶標基因的融合，dsRNA被飼喂進入昆蟲體內實現共沉默是一種很好的RNAi策略，可推廣應用于害蟲防控。

轉基因植物法，即植物介導的昆蟲RNAi，是指將昆蟲靶標基因的dsRNA表達在植物體中，昆蟲取食后生長發育受阻，存活率和繁殖力下降，甚至影響子代生長發育。目前，在小麥、水稻、玉米、棉花、煙草、馬鈴薯、擬南芥等植物中有所應用，主要針對咀嚼式和刺吸式口器昆蟲，如鱗翅目幼蟲、鞘翅目和同翅目害蟲[7]。將昆蟲保幼激素RNAi抗蟲棉和RNAi＋Bt的聚合棉共同應用可大大延緩棉鈴蟲對單一影響策略的抗性[12]。以上方法的關鍵是獲得含有昆蟲靶標基因的轉基因植物。

納米粒子包被和脂質體修飾這2種新型導入方法，會更加有效地提高dsRNA的穩定性，促進中腸吸收，提高RNAi的效率，進而促進昆蟲RNAi研究和害蟲防治應用。納米粒子作為分子載體，通過靜電作用與dsRNA結合，促進腸上皮細胞的胞內傳遞，保護dsRNA不受核酸酶和極端pH環境的影響。納米粒子具有低毒性，可以被細胞高效吸收。納米粒子系統進入昆蟲體內后dsRNA的解離至關重要，它與dsRNA的聚合比例決定Dicer酶作用于dsRNA的能力，因此良好的配比是成功進行RNAi的關鍵。目前，碳量子點、鳥苷酸聚合物、支鏈兩親性多肽膠囊（BAPC）等已成功用于促進昆蟲dsRNA攝取的納米粒子系統[13-14]。脂質體修飾是利用帶正電荷的脂質體與帶負電荷的dsRNA通過靜電作用結合，協助dsRNA的經口轉運和昆蟲細胞培養中的傳遞，具有極好的生物相容性，但在哺乳動物細胞中應用該方法會產生免疫反應，抑制某些酶的活性[15]。

病毒感染法和共生體介導法均是通過以轉基因微生物為基礎生產dsRNA，再通過取食、體壁侵入或韌皮部共生等多種途徑導入昆蟲體內。病毒感染法，即病毒誘導的基因沉默，是將靶標基因dsRNA通過病毒侵染途徑導入宿主體內。此外，RNAi參與抵抗病毒的免疫反應，有3種小分子RNA（小干擾RNA、微小RNA和Piwi蛋白）相互作用，例如，在蚊蟲體內發揮抗蚊媒病毒的免疫作用[16]。研究抗病毒的RNAi途徑，抑制病毒在媒介昆蟲中的復制以及在益蟲（如蜜蜂和家蠶）中利用對非靶標生物安全的病毒序列啟動抗病毒RNAi反應，對防止感染高致病性病毒和開發基于病毒基因的特異性殺蟲劑具有重要意義。物種特有的兼性腸道共生菌比常規微生物飼喂沉默效果好，具有宿主特異性。共生體介導法通過構建缺乏RNase Ⅲ編碼基因來避免dsRNA在微生物體內提前被降解，可以使腸道中dsRNA持續表達，能觀察到各個時期的表型變化。該方法成功的前提是昆蟲具有可培養的共生體。

3 農業害蟲的RNAi應用研究

結合上述dsRNA導入方法，對近幾年農業害蟲（包括鞘翅目、半翅目、鱗翅目等常見的多種害蟲）的RNAi應用研究實例進行整理，結果見表1。其中大部分農業害蟲在特定靶基因的沉默之后，產生死亡表型，具有RNAi田間廣泛應用的潛力，為核酸農藥生產提供參考。目前農業害蟲的田間實際應用防治主要是通過飼喂法以及在飼喂法基礎上建立起來的新型dsRNA導入方法，其中以玉米為主要應用作物的轉基因植物法已經得到美國、巴西和日本等8個國家和地區的安全性評價，并在2017年6月獲得了美國環境署的種植許可[17]，相信在未來發展中會得到更廣闊的應用前景。

表1 農業害蟲RNAi 應用研究實例

4 RNAi效率的影響因素和脫靶效應

4.1 影響因素

昆蟲RNAi技術的應用在基因功能研究和害蟲防控上獲得了長足的進展，但沉默效率的多樣性正制約著該技術的進一步提升。注射法可以將dsRNA高效地導入昆蟲體內引起沉默反應，然而針對大多數鞘翅目和鱗翅目昆蟲，同樣采用飼喂法喂食dsRNA，前者沉默效率在100%左右，而后者卻對RNAi現象不敏感，效率甚至低于50%[41]。究其原因，影響RNAi效率的因素主要有以下幾方面：昆蟲腸道環境、靶標基因的選擇、dsRNA的剪切形式和長度。

4.1.1 昆蟲腸道環境

昆蟲腸道內的消化核酸酶、過堿性pH條件、腸道微生物和圍食膜基質是影響dsRNA穩定的因素，同時也直接關乎RNAi的效率[10]。通過飼喂法導入dsRNA最大的問題就是腸道內的核酸酶和腸道pH環境對dsRNA有強降解作用，破壞基因沉默的初始信號[42]。例如，在東亞飛蝗腸道中，dsRNase2對dsRNA的快速降解是導致口服dsRNA時RNAi效率低下的重要因素[43]。腸道微生物影響腸道的pH值，并分泌可降解dsRNA或干擾腸道細胞攝取的核酸酶。由幾丁質和帶負電荷的糖蛋白組成的圍食膜基質可能會阻止dsRNA有效地進入腸上皮細胞，且膜孔的大小影響dsRNA傳遞。

4.1.2 靶標基因的選擇

RNAi技術成功應用的重點是通過高通量篩選和基因功能驗證確定害蟲高致死性的靶標基因，從而進一步判斷是否可作為害蟲防控的RNAi靶點。首先，昆蟲在細胞和組織水平上是通過受體介導的內吞作用攝取dsRNA，所以與細胞膜運輸相關的基因靶點似乎是一些最致命的昆蟲RNAi靶點[44]。其次，在幼蟲和成蟲發育時期的關鍵基因可以作為致死基因。卵期和蛹期昆蟲處于表面靜止狀態，無法取食dsRNA，之后昆蟲將進入活動性強的幼蟲期或成蟲期，發生取食危害，篩選卵期和蛹期關鍵致死基因對于害蟲防治至關重要，如沉默與褐飛虱蛻皮相關的NlRan基因后，褐飛虱因蛻皮困難致死，雌蟲繁殖能力受到影響[45]。

4.1.3 dsRNA的剪切形式及長度

Dicer酶對dsRNA進行剪切是整個RNAi過程的關鍵步驟，不同物種昆蟲dsRNA的剪切形式是RNAi效率不同的原因之一[46]。有研究[47]發現，dsRNA的剪切偏好性位點在鞘翅目中呈現多樣性，而在鱗翅目昆蟲中Dicer酶的剪切偏好位點是GGU，這可能是導致在兩種目中RNAi效率存在較大差異的原因，也可能是導致物種間RNAi效率不同的原因。此外，dsRNA的長度也影響RNAi效率。赤擬谷盜中發現只有大于31 bp的小分子RNA才能誘導RNAi產生[48]；植物介導昆蟲RNAi防治害蟲的靶標基因dsRNA長度應大于60 bp，且在一定范圍內長度越長，RNAi效率越高[49]。

4.2 脫靶效應

基因沉默的準確性是由siRNA參與介導的，siRNA引導的基因沉默不僅可以和靶標基因結合，由于導入片段的特異性不強，也可以和非靶標基因結合導致基因沉默，這種現象稱為脫靶效應[50]。目前基因編輯技術的應用都會存在脫靶效應的風險，使得靶標基因表達水平沒有發生顯著變化。導致脫靶效應產生的因素有很多，當dsRNA與mRNA的匹配長度超過相應堿基對后就會產生較高的脫靶效應。在黑腹果蠅和秀麗隱桿線蟲的研究中發現，前者匹配長度超過19 bp后會產生較高的假陽性結果，而后者則在超過40 bp且相似性高于95%時會出現脫靶效應[45]。如果將設計的dsRNA針對的mRNA序列與其他基因比對分析后沒有發現連續19 bp的堿基完全相同，則基本就可以保證特異的對靶標基因進行沉默。此外，RNAi脫靶效應的產生與siRNA/dsRNA的濃度有關。設計適宜濃度的混合siRNA/dsRNA進行干擾比單一轉染的siRNA或者dsRNA更能降低脫靶效應[10]。現有研究[44]表明，如果針對同一基因的不同區域設計多種dsRNA，則可以有效避免脫靶效應。

田間脫靶效應的出現會使靶標生物的非靶標基因沉默，也可能會導致其他非靶標生物甚至有益生物基因沉默，從而產生一系列潛在的安全性問題，如Bachman等[51]報道了玉米根螢葉甲的Snf7基因dsRNA對不同昆蟲的脫靶效應。然而，正確地運用脫靶效應的原理，通過比較不同生物基因組序列，選擇有害生物物種間保守而有益生物同源性低的序列作為靶標基因，可在昆蟲防控研究應用上將植物介導的昆蟲RNAi和核酸農藥設計得更廣譜和安全。

5 結語與展望

RNAi技術作為21世紀的變革性技術，不但在研究昆蟲不同發育階段的基因功能上發揮了重要作用，而且RNAi技術也為害蟲防治提供了極具潛力的特異性殺蟲劑研發新思路。目前，孟山都公司預計2020年上市基于RNAi開發的防控農業害蟲和病毒的核酸農藥產品[52]。雖然該項技術直接用于害蟲防治還存在制造成本高、易受環境影響等因素限制，但相信隨著昆蟲分子生物學研究的不斷深入，RNAi技術在昆蟲防控研究中的應用也會更加廣泛。合成dsRNA效率的提高、核酸生物農藥的研發和應用成本的降低，終將會促使其從實驗室走向田間，推動植物保護技術取得更大發展。