紫薯醋發酵工藝優化及品質分析

曹楨，陳善敏，黃小雨，蔣和體

(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)

甘薯營養成分豐富,紫薯不同于傳統的甘薯品種，還擁有含特殊保健功能的花青素、硒元素、花色苷等，因而具有抗氧化、緩解高血壓和增強記憶力等多種功能。TANG等[1]對3種薯色紫薯進行成分測定分析，發現紫心紫薯由于富含花青素，其抗氧化能力遠高于橘心和白心紫薯。

紫薯在傳統加工領域如鮮食、飼料、方便小食品等方面應用廣泛，但加工方法單一，附加值低。紫薯中活性成分豐富，將其釀醋，能最大限度增加經濟效益。食醋的風味和營養價值是評價食醋品質是否優良的重要指標[2]，而紫薯醋中的各種活性成分含量決定了紫薯醋的營養價值。目前對這些活性成分的研究主要集中在含量動態變化、品種差異、活性成分的提取、分離純化、抗氧化作用等方面[3-4]。

紫薯花色苷是紫薯中最主要的活性成分，許多研究表明，其與體外抗氧化能力密切相關，且在一定濃度范圍內，花色苷濃度與體外抗氧化能力成正相關，而紫薯花青素在復雜的發酵過程中，因發酵時間過長、溫度較高等因素而損失[5-6]。本研究探究了在發酵紫薯醋的工藝流程中保存紫薯中活性物質的一種方法，提高了紫薯醋的營養價值，提升了紫薯的附加價值，對紫薯深加工產品具有一定理論指導意義。

1 試驗材料

1.1 材料與試劑

渝紫7號，重慶市石柱縣；紫薯酒，實驗室自制；釀酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌巴氏亞種1.41，中國微生物菌種保藏管理中心。

3，5-二硝基水楊酸、石油醚、丙酮、碳酸鈣、硫酸鎂(分析純)，重慶川東化工有限公司；磷酸二氫鉀(分析純),成都市科龍化工試劑廠;DPPH(95%)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪) 二鹽酸鹽[2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH]、熒光素鈉(分析純),阿拉丁試劑有限公司;抗壞血酸、β-胡蘿卜素、沒食子酸、蘆丁(標準品)、福林酚試劑(分析純)，SOLARBIO生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-26 電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；HDL-4 離心機，金壇市鴻科儀器廠；(T)YAIBO 15/8 高壓滅菌鍋，上海宜川上嶺儀表有限公司；QP2010氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；UNICO 7200 分光光度計，上海巴玖實業有限公司；R502B 旋轉蒸發儀，西安太康生物科技有限公司；UltraScan PRO 全自動色差儀，美國Hunter Lab公司；SYHERGY H1 多功能酶標儀，5BioTek有限公司；SHB-Ⅲ 循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫薯醋釀造工藝流程

1.3.1.1 紫薯醋釀造工藝流程

紫薯醋釀造工藝流程如下：

1.3.1.2 紫薯色素回添醋釀造工藝流程

紫薯色素回添醋釀造工藝流程如下

1.3.1.3 操作要點

(1)紫薯粉：鮮紫薯洗凈，切成3 mm薄片，真空冷凍干燥24 h，粉碎后過80目篩得紫薯粉，裝袋放于干燥器避光保存。

(2)微波輔助提取紫薯色素[7-8]：以10 g/L的檸檬酸溶液為提取劑，紫薯粉做原料，在微波功率為560 W，液料比為22.8 mL/g時作用4.6 min，反復3次，離心(3 500 r/min,10 min)后保留上清液。

(3)糖化液化：紫薯渣為原料，按0.5 mg/kg添加α-淀粉酶，45 ℃作用4 h。

(4)酒精發酵：酶解后的原料接種活化后的酵母菌，25 ℃下發酵。

(5)醋酸發酵：調整酒精發酵液的初始酒度為7.35%vol、裝液量為28%、溫度為30 ℃、發酵時間11 d。

1.3.2 基礎指標測定

總糖采用3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)比色法；總酸采用GB/T 12456—2008中pH電位法；β-胡蘿卜素采用比色法[9]；VC采用GB 5009.86—2016 2,6-二氯靛酚滴定法；總酯采用GB/T 19777—2013地理標志產品 山西老陳醋中的連續電位滴定法；總酚測定采用Folin-Ciocalteu比色法[10]；總黃酮采用SN/T 4592—2016 出口食品中總黃酮的測定。

1.3.3 色澤的測定

色差計法[11-12]。根據CIELAB色彩空間，測定紫薯醋的亮度值L*、紅綠值a*和黃藍值b*，同一樣品取6個不同位置測定，取平均值，并按照公式(1)、公式(2)計算其彩度C*和色調角H0。

(1)

(2)

1.3.4 花青素的測定

采用pH示差法[13]。總花青素含量按公式(3)和公式(4)計算。

(3)

A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH4.5

(4)

式(3)中：A為公式(4)計算所得；Mw為分子質量(449.2 g/mol)，DF為稀釋倍數，ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數[26 900 L/(mol·cm)]，l為光程(1.0 cm)。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 氧化自由基吸收能力

參照TEOW[14]的方法。AUC(area under curve)值和氧化自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)值按公式(5)、公式(6)計算，結果以μmol/mL表示。

AUC=4×f0+f1+...fn-1+fn-f0-fn

(5)

(6)

式(5)中:AUC，熒光衰退面積；fn，第n個測定點的相對熒光強度。

1.3.5.2 DPPH自由基清除率

參照RUMBAOA[15]的方法。結果按公式(7)進行計算，以 μg/mL表示。

DPPH/(μg·mL-1)=x×DF

(7)

式(7)中：x，吸光度對應標準曲線上的質量濃度，μg/mL。

1.3.6 香氣成分萃取與分析

1.3.6.1 同時蒸餾萃取法萃取紫薯醋揮發性成分

分別量取50 mL紫薯醋和50 mL二氯甲烷于2個500 mL圓底燒瓶，紫薯醋放置于樣品端，油浴加熱并保持溶液微沸。溶劑端于50 ℃水浴中回流2 h。回流結束后，加入3～5 g無水Na2SO4并放于-20 ℃冰箱過夜除水，取出快速過濾，然后旋蒸濃縮至5～6 mL，再氮吹至1 mL，置于-20 ℃條件下，以待GC-MS聯機分析[16]。

1.3.6.2 氣相色譜條件

色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃；升溫程序：45 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至80 ℃，以7 ℃/min升至150 ℃，以6 ℃/min升至200 ℃，以1 ℃/min升至210 ℃，以7 ℃/min升至230 ℃；載氣流量1.0 mL/min；不分流進樣[17-18]。

1.3.6.3 質譜條件

電離方式：電子電離EI源；電子能源70 eV；燈絲發熱電流0.25 mA；電子倍增器1 000 V；離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍(m/z)40～450[17]。

1.3.6.4 揮發性成分的定性與定量分析

GC-MS檢測所得化合物質譜圖經質譜庫(NIST05.LIB/NIST05 s.LIB)檢索，結合檢索結果相似性高低及保留指數法進行定性，采用2-辛醇為內標物，按照面積歸一化法確定各香氣組分的相對含量。

1.3.7 數據處理與分析

采用SPSS進行數據分析，Origin作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵時間對醋酸發酵的影響

由圖1可知，在0～11 d的發酵期內，前7 d紫薯醋的總酸含量增加量較緩慢，7 d后增速顯著加快，在第11天總酸含量達到5.68 g/100 mL，11 d后，總酸含量變化幅度小，考慮到時間成本，選取發酵時間為11 d。

圖1 發酵時間對紫薯醋總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total acid of sweet potato vinegar

2.2 初始酒度對醋酸發酵的影響

由圖2可知，可以觀察到酒精度為7%vol時的初產酸量要顯著高于9%vol和11%vol的初始產酸量，但4 d以后該趨勢消失，但整體趨勢都是隨著發酵時間的延長，醋酸含量也緩慢增加。這可能是酒精度9%vol和11%vol，會對醋酸菌的生長有一定抑制作用，但同時醋酸菌也能利用一部分底物進行產酸，但產酸量低于酒精度7%vol。4 d以后，底物對醋酸菌的抑制作用減弱，酒精度為9%vol中的醋酸菌開始大量繁殖產酸，而11%vol組仍對醋酸菌有抑制作用。從總酸含量來看，初始酒度為9%vol的發酵效果較好，但考慮到發酵底物的節約，選擇7%vol為最佳初始酒度。

圖2 酒精度對紫薯醋總酸含量的影響Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid of sweet potato vinegar

2.3 裝液量對醋酸發酵的影響

裝液量對紫薯醋總酸含量影響如圖3所示。除了裝液量20%外，其他組在0～6 d，產酸量差別不大，6 d之后，裝液量越少，產酸量增加比例越大，產酸越多，其中裝液量為25%時，總酸含量最大可達6.48 g/100mL。而裝液量過低(20%)，雖然前期產酸量快，但發酵中期后，隨著溶氧度以及發酵底物的損失，生成的醋酸進一步氧化為二氧化碳和水，造成醋酸含量最低。綜合考慮，選取25%作為最佳裝液量。

圖3 裝液量對紫薯醋總酸含量的影響Fig.3 Effect of the liquid volume on total acid of sweet potato vinegar

2.4 響應面設計

基于單因素試驗，采用Box-Benhnken 試驗原理，將總酸度作為響應值，設計發酵時間(A)、初始酒度(B)、裝液量(C)3因素3水平的中心組合試驗，并通過試驗得到響應面結果，響應面設計及結果見表2。

表2 響應面設計與結果Table 2 Experimental design and result of response surface design

2.4.1 回歸模型的建立及顯著性分析

總酸是醋品品質評價的重要指標，因此，本試驗將總酸含量作為響應值，對發酵時間(A)、初始酒度(B)與裝液量(C)3個因素進行響應面分析，優化紫薯醋酸發酵工藝。按表2進行回歸分析，總酸含量(R)的回歸方程如下：

R=-9.748 52+2.598 92A-18.025 30B+5.286 13C-0.108 50AB-0.023 650AC-0.107 50BC-0.032 525A2+1.246 23B2-0.066 861C2。

根據方差分析結果(表3)，模型P值為0.019 0，表明模型項顯著；失擬項P值0.783 1不顯著，表明在試驗參數范圍內，模型合理，可用來推測與分析紫薯醋酸發酵試驗結果。方程決定系數R2(Adj)=0.872 9，變異系數<15%，表明響應值總酸含量的實際值與預測值之間具有良好一致性，模型可靠。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

前文分析過，F值的因素其對響應值影響越顯著。因此，3個因素對總酸含量的影響順序為B(初始酒度)>C(裝液量)>A(發酵時間)，其中一次項B、平方項B2、C2對響應值影響極顯著(P<0.01)，其他因素組合對總酸含量無顯著影響(P>0.05)。

2.4.2 驗證試驗

經響應面法優化，得紫薯醋酸發酵最優條件為發酵時間11.23 d，初始酒度7.35%vol，裝液量27.66%vol，總酸含量7.064 g/100g。為更好操作，調整工藝條件為發酵時間11 d，初始酒度7.35%，裝液量28%。經過3次重復性試驗，總酸含量為6.92 g/100mL，與模型預測值相差較小，誤差為±0.43%。該模型能夠較好預測醋酸發酵條件與總酸含量的關系，模型可用。

2.5 指標測定結果分析

2.5.1 指標測定結果

指標測定結果見表4，除了總糖含量無顯著差異外，2種紫薯醋的其他指標均差異顯著(P<0.05)。紫薯色素回添醋的總酸、總酯、總多酚、總黃酮、花青素含量和抗氧化能力均強于紫薯醋。同時，提取色素后損失較多的營養成分為維生素。此外，紫薯醋的亮度值L*、紅綠值a*和黃藍值b*均大于紫薯色素回添醋且存在顯著性差異(P<0.05)，亮度值越大，醋品的顏色反而越淺，紫薯色素回添醋的顏色要深于紫薯醋。這是因為提取后的紫薯花青素回添到紫薯醋中后，其在酸性條件下穩定且呈深紫色[19]。

表4 兩種紫薯醋品質指標Table 4 Quality indicators of different purple sweet potato vinegar

2.5.2 活性成分損失對比

紫薯原料和2種紫薯醋中發酵前后活性成分含量及損失率見表5。由表5可知，未經發酵的紫薯原料中活性成分含量最高，其總多酚、總黃酮和花青素含量分別為2 303.06、281.74和346.22 mg/L，紫薯色素回添醋次之，紫薯醋最低且三者間具有顯著性差異(P<0.05)。發酵使紫薯原料中的活性成分損失較大，對于直接發酵的紫薯醋來說，總多酚、總黃酮、花青素含量較原料分別損失75.59%、63.63%和72.75%，均超過50%，而采用先發酵再回添的發酵方式制得的紫薯色素回添醋較紫薯醋的總多酚、總黃酮、花青素損失率分別降低10.34%、15.61%和42.93%，其中，該發酵方式對花青素的保存尤其顯著，這說明提取色素后再回添的方式有利于紫薯中活性成分的保存。

表5 紫薯原料與2種紫薯醋活性成分損失對比Table 5 Active ingredient loss comparison of purple sweet potato and two kind of its vinegar

2.6 香氣成分分析

采用GC-MS技術對2種紫薯醋濃縮物進行測定和分析，峰表對照數據庫進行檢索和解析，結合文獻，分別鑒定出各濃縮液的揮發性香氣成分及香氣描述，2種紫薯醋共鑒定出114種揮發性香氣成分，包含酸類18種，酯類37種，醇類18種，酚類3種，醛酮類17種，烷烴類14種，其他物質7種。但2種紫薯醋所鑒定出的揮發性香氣成分的種類和含量具有較大差異，見圖4。2種紫薯醋所鑒定出的相同組分一共有41種，包含有8種酸類，12種酯類，6種醇類和醛酮類，7種烷烴類，其他化合物2種。此外，紫薯醋和紫薯色素回添醋中分別鑒定出76種和82種揮發性香氣成分，雖然2種紫薯醋鑒定出的化合物數量相差較小，但化合物種類有較大差異，紫薯醋中醛酮類和酚類物質較多，而紫薯色素回添醋中含有較多醇類和烷烴類物質。研究表明，紫薯醋中所含的主要香氣成分有乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯、苯甲醛、大馬士酮等[17, 20]。

a-物質數量；b-相對含量圖4 兩種紫薯醋萃取得到的物質數量和相對含量Fig.4 The number and relative content of components extracted by two purple sweet potato vinegar

酸類物質大多由酯類降解生成，其中本文中含量較高的乙酸是醋酸發酵的結果，而2種紫薯醋中共有的酸類物質均有刺激性味道。但由于酸類物質香氣閾值較高[21]，因此不是主要的風味物質，而主要起調節作用。

許多酯類呈現鮮明的果香、花香，其產生途徑包括酵母的酶促反應和有機酸與醇的酯化反應[22]。醋酸發酵原料紫薯酒中乙醇含量較高，同時在酵母菌、醋酸菌以及其他微生物的作用下，生成更多酸類、醇類物質，而這2種物質在發酵和陳釀期間發生酯化反應從而生成酯類物質，在2種紫薯醋中，分別有24種和28種酯類，其中共有的乙酯類化合物有8種，它們可能是乙醇與紫薯酒在發酵過程中生成的酸類物質反應的結果。

多數醇類具有花草香或者果香，本次2種紫薯醋檢測出的主體醇類物質有苯乙醇(22.47%和13.53%)、正癸醇(1.7%和10.30%)、1-十一醇(0%和1.46%)。苯乙醇呈現愉快的玫瑰香，正癸醇具有甜花香，1-十一醇具有檸檬香氣[23]。雖然醇類物質的風味閾值一般較高，但在賦予醋品醇香以及脂肪酸酯化方面可以起到積極作用[24]。但由于萃取方法為同時蒸餾萃取法，因對樣品進行加熱處理，大分子化合物可經Stretcher降解繼續生成較小分子量的醛，進而還原為醇[25]。本次研究中所檢測出的苯乙醇，很大可能就是經過該途徑生成。

至于物質數量相對較少的烷烴類和其他類，兩者相對含量僅占化合物總量的3.27%和12.01%，其中烷烴類對醋品風味基本沒有貢獻。此外，紫薯醋中還特有3種酚類物質，分別為愈創木酚(0.37%)、對乙烯基愈創木酚(0.17%)、丁香酚(0.02%)，呈現出特殊芳香、強烈香辛料和發酵似香氣以及濃郁石竹麝香[26]，雖相對含量較低，但由于其香氣閾值較低，對醋品香氣貢獻較大。

3 結論

采用響應面法優化醋酸發酵條件，并對這2種醋品進行指標測定及比較研究。優化后的紫薯醋酸發酵條件為發酵時間11 d、初始酒度7.35%vol、裝液量28%，此條件下，總酸含量為6.92 g/100g。2種發酵方式同時在其最優條件下進行發酵。與紫薯醋相比，紫薯色素回添醋除總糖和維生素含量較低外，其總酸、總酯、總多酚、總黃酮、花青素含量和抗氧化能力均強于紫薯醋且具有顯著性差異(P<0.05)。采用紫薯醋新發酵工藝可使總多酚、總黃酮、花青素的損失率較傳統發酵工藝分別降低10.34%、15.61%和42.93%。揮發性成分分析顯示2種紫薯醋中鑒定出的揮發性成分的化合物數量相差較小，種類卻有較大差異。同時，紫薯花青素的提取過程會導致一些對醋品香氣有貢獻的化合物的損失。