嗜酸乳桿菌上清液制備及其對PC12細胞增殖的影響

＊彭友 魏佳旭 衣爽 祖繼宏 趙雨竹

（吉林農業科技學院 吉林 132101）

中樞神經系統退行性疾病目前常用的治療方法主要包括藥物、外科手術和細胞移植，然而這些方法效果并不理想，常伴有一定的副作用。近年來，研究發現腸道菌群組成和數量的改變對中樞神經系統疾病的預防和治療有著重要的作用，同時人體自身也能夠通過相應的組織和器官對腸道的菌群進行調節，從而使腸道微生態達到平衡。嗜酸乳桿菌是益生菌中具有代表性的菌種之一，其在腸道、陰道、口腔等器官定殖。研究發現益生菌具有抗腫瘤，調節免疫等有益功效，補充益生菌還可以積極改善抑郁癥或焦慮等癥狀，因此這類細菌也被稱作精神性微生物。目前關于腸道細菌和中樞神經系統之間的相互影響已有許多研究基礎，但對腸道菌群與神經類細胞之間的研究較少。因此，本實驗通過獲取嗜酸乳桿菌培養上清液來研究其對體外培養PC12細胞增殖的影響。

1.實驗方法和實驗材料

(1)實驗材料

RPMI1640細胞培養基，胎牛血清，PC12細胞株，嗜酸乳桿菌凍干菌體（保藏編號：ATCC 4356），MRS培養基，Cell Counting Kit 8（CCK-8）試劑盒。

(2)實驗方法

①嗜酸乳桿菌的培養。準備蒸餾水100mL，同時準備MRS粉末，用電子天平稱取6.62g。將稱好的粉末放入蒸餾水中溶解。隨后對液體進行高壓滅菌處理，時間15min，恢復常溫后得到MRS液體培養基，隨后利用其進行凍干菌體的復蘇，在輕微振蕩后將其溶解，溶解后進行分裝。置于37℃培養箱內24h。次日，準備MRS液體培養基，取部分復蘇后的嗜酸乳桿菌加入到其中，置于37℃培養箱內24h，連續兩次分離培養。

②生長曲線測定。當嗜酸乳桿菌的種子液OD600值為1時，以3%體積比將其加入100mLMRS液體培養基中。在37℃環境下靜置培養。每間隔2h要進行取樣，每次取樣設置三個平行組，測量在600nm波長下的吸光值。隨后進行生長曲線的繪制，縱坐標為OD600的值，時間是橫坐標。

③嗜酸乳桿菌上清液的制備。準備MRS液體培養基，體積為100mL，向其中加入嗜酸乳桿菌種子液，體積比為3%，隨后進行靜置培養，溫度為37℃，時間為28h。培養后對其進行離心，時間為15min，轉數為8000r/min，離心后保留上清液將沉淀除去，隨后過濾，先后利用0.45μm和0.22μm孔徑的濾膜。把濾出的液體加到準備好的MRS培養基中進行觀察，時間為一個星期，如果培養基上沒有出現細菌生長繁殖的情況，就可以對其進行保存備用，保存溫度為4℃。

④細胞形態學影響。PC12細胞懸液密度進行調整至5×104cells/mL后接入96孔板，以100μL/孔培養。在經過12h后將獲取的上清液分別以體積分數2%、4%、6%加入孔板中繼續進行培養，同時設置不加上清液的對照組，每組設置三個平行組。2d后在顯微觀察生長情況并拍照記錄。

⑤細胞增殖影響。重復1.2.4的方法培養2d后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，將96孔板放在培養箱培養4h。后用酶標儀測450nm處吸光度值，計算存活率。細胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.結果與分析

(1)嗜酸乳桿菌的生長曲線

如圖1所示，嗜酸乳桿菌培養一共分為四個階段，其中0-7h處于遲緩期，7-20h為對數生長期，20-30h為穩定期，30h后是衰亡期。因此，本實驗所需上清液從培養時間28h左右的細菌液體培養基中獲取。

圖1 嗜酸乳桿菌的生長曲線

(2)L.a.s對PC12細胞的形態學影響

如圖2所示，發現細胞貼壁生長，此時為培養2d后的PC12細胞生長情況，且隨著上清液濃度增加，細胞密度也隨之增加，細胞形態沒有顯著變化。

圖2 PC12形態學圖片

(3)L.a.s對PC12細胞的增殖影響

如圖3所示，通過利用CCK-8法，發現隨著L.a.s體積分數的增加，細胞存活率也隨之增加。其中，6%L.a.s處理組能夠使得細胞存活率發生很大變化。其主要表現為提升細胞的存活率，并且能夠提升至對照組的131.31±4.59%。

圖3 不同體積分數L.a.s對PC12增殖情況

(4)L.a.s對PC12細胞熒光染色結果

如圖4所示，利用熒光顯微鏡觀察PC12細胞的染色情況。A為對照組，B、C、D組分別對應為不同體積分數的L.a.s處理組，相比于對照組，C1、C2和D1、D2組細胞數量更多，染色結果與顯微鏡下的觀察一致，說明細胞狀態正常。

圖4 PC12染色熒光圖片

3.結論

通過將培養時間為28h的L.a.s按不同體積分數作用于PC12細胞，熒光染色和CCK-8細胞增殖檢測結果表明，PC12細胞能夠正常生長。而6%L.a.s處理組能夠將PC12細胞的存活率提高至未處理組的131.31±4.59%，說明一定濃度下的L.a.s具有促進PC12細胞的作用。本研究并未對上清液中的具體有效成分進行分析，后續可以考慮對其進行詳細分析，篩選出對PC12細胞增殖促進的主要成分，為進一步研究其神經保護作用打下基礎。