隱丹參酮納米混懸劑的制備及其抗腫瘤活性

李曉婷，決利利，郝海軍，王世廣

（1.鄭州工業應用技術學院醫學院，河南鄭州 451150；2.中國醫藥工業研究院，上海 201203）

隱丹參酮是從唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.中提取得到的主要脂溶性活性成分之一［1］，對胃癌、宮頸癌、肺癌等多種腫瘤細胞具有明顯抑制作用［2］，也對心肌梗死、擴張冠狀動脈、活血化瘀等心血管疾病有著較好的治療作用，但它屬于難溶性成分［2］，從而大大限制了其藥效發揮［3］，成為相關臨床應用的瓶頸。雖然磷脂復合物、自微乳、脂質體等技術解決了一些難溶性藥物藥效較低的問題，但均存在一定局限性，如穩定性差、制備工藝復雜、大量使用表面活性劑等。

納米混懸劑是通過加入穩定劑后采用某種制劑技術而制備得到的一種亞微米膠體給藥體系［4-5］，它無需載體材料，可有效避免共溶劑的不良反應，并可顯著提高藥物溶解度和療效。因此，本實驗將隱丹參酮制成納米混懸劑，對其粒徑、Zeta 電位、形態、穩定性、體外釋藥進行考察，并采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法研究它對人胃癌細胞SGC-7901 的抑制作用，以期為進一步相關研究提供參考。

1 材料

QUINTX224-1CM 型電子天平（德國Sartorius公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；JY92-III 型超聲儀（浙江大天科學儀器有限公司）；SZCL-H 型溫控磁力攪拌器（鄭州宇華儀器有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；FD10-QX 型真空凍干機（上海天賜科學儀器公司）；Kylin-Bell 型漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；MR-96T 型酶標儀（南京貝登醫療股份有限公司）；HNA-122DTABA I 型CO2恒溫培養箱（日本三洋公司）。

隱丹參酮原料藥（批號Y-034-181217，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；隱丹參酮對照品（批號110852-201702，純度99.5%，中國食品藥品檢定研究院）。大豆卵磷脂（批號PC-95，上海輔必成醫藥科技有限公司）；泊洛沙姆188（批號WPEE578，德國巴斯夫公司）；胰蛋白酶（美國HyClone 公司）；RPMI-1640 培養基（美國Gibco 公司）；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號1524B37，美國Amresco 公司）。人胃癌SGC-7901 細胞，購自上海研域生物工程有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.5% 甲酸（72∶28）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長272 nm；進樣量20 μL。

2.2 隱丹參酮納米混懸劑制備 取大豆卵磷脂、泊洛沙姆188 各200 mg，超聲溶解于100 mL 蒸餾水中，作為溶液A；取隱丹參酮100 mg，超聲溶解于10 mL 無水乙醇中，作為溶液B。設置磁力攪拌器溫度為70 ℃，轉速為800 r／min，將溶液B 逐滴加到溶液A 中，同一溫度下真空濃縮除去乙醇，設置均質壓力為80 MPa，循環10 次后補加蒸餾水至100 mL，即得。

2.3 隱丹參酮納米混懸劑理化性質研究

2.3.1 粒徑、Zeta 電位測定 取3 批隱丹參酮納米混懸劑，蒸餾水按照1∶6 比例稀釋后置于粒度分析儀上，測定粒徑、Zeta 電位，結果見圖1～2。由此可知，納米混懸劑粒徑分布在50～200 nm 之間，平均粒徑為104.15 nm，PDI 為0.014，Zeta電位為-36.3 mV。

圖1 隱丹參酮納米混懸劑粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of cryptotanshinone nanosuspensions

圖2 隱丹參酮納米混懸劑Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of cryptotanshinone nanosuspensions

2.3.2 形態 取隱丹參酮納米混懸劑、空白納米混懸劑各100 μL，加入4 mL 蒸餾水，搖勻后滴至銅網上，自然晾干，滴加1.0% 鎢酸鈉溶液染色，靜置10 min，濾紙吸干后置于透射電鏡（TEM）下觀察形態，結果見圖3～4。由此可知，隱丹參酮納米混懸劑中納米粒之間無粘連現象，基本呈球形；空白納米混懸劑中納米粒形態類似囊泡結構，可能是由于其中的表面活性劑（磷脂）未吸附于納米粒表面，而是分散在水相中形成該類結構。

圖3 隱丹參酮納米混懸劑TEM 圖Fig.3 TEM image for cryptotanshinone nanosuspensions

2.4 隱丹參酮納米混懸劑穩定性研究

圖4 空白納米混懸劑TEM 圖Fig.4 TEM image for blank nanosuspensions

2.4.1 室溫下 取隱丹參酮納米混懸劑（蒸餾水將其質量濃度稀釋至0.5 mg／mL），室溫下于0、1、3、5、7、15、21、30 d 測定粒徑，結果見圖5。由此可知，15 d 后粒徑增大了約10 nm，而30 d后增大了約21 nm，但肉眼未發現沉淀或聚集現象。

圖5 室溫下隱丹參酮納米混懸劑粒徑Fig.5 Particle size of cryptotanshinone nanosuspensions at room temperature

2.4.2 空白血漿、1.8%氯化鈉溶液中 將隱丹參酮納米混懸劑與空白血漿按1∶4 比例混合，或與1.8%氯化鈉溶液按1∶1 比例混合（質量濃度為0.5 mg／mL）后，置于37 ℃水浴中，于0、1、2、4、6、8、10、12 h 測定粒徑，結果見圖6。由此可知，加入空白血漿、1.8%氯化鈉溶液后，與加入前（104.15 nm）相比0 h 粒徑分別增加約42、36 nm，隨著時間延長均逐漸升高，在12 h 后仍均小于162 nm，而且在1.8%氯化鈉溶液中的變化程度更小，故可考慮將其作為注射分散介質。

2.5 隱丹參酮納米混懸劑凍干粉制備

2.5.1 冷凍干燥工藝 將隱丹參酮納米混懸劑分成若干份，每份3 mL，置于西林瓶中，加入凍干保護劑，混勻，置于真空凍干機中（初始溫度-55 ℃），按照圖7 程序進行冷凍干燥，并在25 ℃下保持4 h，即得淺紅色疏松的凍干粉，其色澤均勻，外形飽滿，再分散性良好。

圖6 空白血漿、1.8%氯化鈉溶液中隱丹參酮納米混懸劑粒徑Fig.6 Particle sizes of cryptotanshinone nanosuspensions in blank plasma and 1.8% sodium chloride solution

圖7 冷凍干燥程序Fig.7 Lyophilization procedure

2.5.2 凍干保護劑種類及用量 取不同質量分數甘露醇、乳糖、蔗糖，加入到隱丹參酮納米混懸劑中，冷凍干燥后取適量凍干粉，加入蒸餾水復溶后測定粒徑、Zeta 電位，結果見表1。由此可知，加入3%甘露醇后凍干粉粒徑、Zeta 電位與冷凍干燥前（104.15 nm、-36.3 mV）相比變化最小，故選擇其作為凍干保護劑。

表1 凍干保護劑種類及用量對粒徑、Zeta 電位的影響（n＝3）Tab.1 Effects of lyoprotectant kind and consumption on particle size and Zeta potential（n＝3）

2.6 隱丹參酮納米混懸劑體外釋藥研究 用2 mL 1.5%十二烷基硫酸鈉溶液分別制備隱丹參酮及其納米混懸劑凍干粉的混懸液（含10.0 mg 隱丹參酮），置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），兩端扎緊。以900 mL 1.5%十二烷基硫酸鈉溶液為釋放介質，設定溫度為（37 ± 1）℃，轉速為100 r／min［6-7］，于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48 h 各取樣3 mL 后，立即補加3 mL空白溶出介質以保持總體積不變，取樣液過0.45 μm微孔濾膜，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，體外釋放曲線見圖8，可知原料藥在24 h 內累積釋放度僅為23.17%，之后幾乎沒有釋放，這與其溶解度差、顆粒大等因素有關；納米混懸劑在前12 h 釋放相對較快，累積釋放度達到64.28%，之后呈明顯緩釋特征；釋藥過程最符合Higuchi 模型，見表2。

圖8 隱丹參酮體外釋放曲線Fig.8 In vitro release curves for cryptotanshinone

表2 藥物釋放擬合結果Tab.2 Results of drug release fitting

2.7 隱丹參酮納米混懸劑對SGC-7901 細胞的抑制作用

2.7.1 藥液制備 將30.0 mg 隱丹參酮溶于100 mL DMSO 中，得到300 μg／mL 母液，用含10%FBS 的RPMI-1640 培養液將其依次稀釋至30、24、18、12、6 μg／mL；取隱丹參酮納米混懸劑凍干粉，用含10% FBS 的RPMI-1640 培養液將其依次稀釋至30、24、18、12、6 μg／mL（以隱丹參酮計），即得。

2.7.2 分組與給藥 采用MTT 法。取對數生長期的SGC-7901 細胞，0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單細胞懸液，細胞培養液調整其濃度為5×105／mL，取100 μL 接種于96 孔板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養12 h，棄去培養液，設置空白對照組（細胞加培養液）、隱丹參酮組（30、24、18、12、6 μg／mL）、隱丹參酮納米混懸劑組（30、24、18、12、6 μg／mL），每個質量濃度3 個復孔。繼續培養6、12、24、48 h 后，每孔加入20 μL 0.5%MTT 溶液，繼續孵育4 h 后甩板，每孔加入150 μL DMSO，固定于搖床上振蕩1.0 h 以充分溶解藍紫色結晶物，在參比波長630 nm、主波長570 nm 的酶標儀中測定吸光度（A），計算抑制率，公式為抑制率＝ ｛1 -［（A空白對照組-A給藥組）／A空白對照組］｝ ×100%，通過GraphPad Prism 5 軟件計算IC50，SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。

2.7.3 結果分析 表3 顯示，隨著藥物質量濃度增加，隱丹參酮及其納米混懸劑對SGC-7901 細胞的抑制作用均更明顯，并且在藥物質量濃度相同的情況下隨著作用時間延長，該活性也逐漸增強，即呈濃度、時間依賴性；在藥物質量濃度相同的情況下，納米混懸劑抑制作用均強于原料藥，而且后者作用48 h 后各質量濃度下抑制率與前者比較，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；IC50分別為24.72、11.76 μg／mL，兩者比較，差異也有統計學意義（P＜0.01）。

表3 隱丹參酮納米混懸劑對SGC-7901 細胞的抑制率（， n＝3）Tab.3 Inhibitory rates of cryptotanshinone nanosuspensions on SGC-7901 cells（， n＝3）

表3 隱丹參酮納米混懸劑對SGC-7901 細胞的抑制率（， n＝3）Tab.3 Inhibitory rates of cryptotanshinone nanosuspensions on SGC-7901 cells（， n＝3）

注：與隱丹參酮組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3 討論

納米混懸劑中的表面活性劑可吸附于納米粒表面，提供立體位阻作用，防止粒子之間發生聚集現象，從而提高制劑穩定性，但表面活性劑對納米粒粒徑、Zeta 電位的影響較大。前期預實驗對不同表面活性劑進行篩選，發現粒徑大小由低到高依次為大豆卵磷脂、泊洛沙姆188、聚乙烯醇、聚山梨酯80。研究表明，幾種表面活性劑聯合應用有助于提高制劑長期穩定性［6］，故本實驗最終采用采用大豆卵磷脂、泊洛沙姆188（比例1∶1）作為表面活性劑。

體外抗腫瘤實驗結果顯示，在相同用藥劑量下隱丹參酮納米混懸劑對SGC-7901 細胞的抑制作用強于原料藥，其原因一方面可能是由于納米粒能通過非特異性內吞作用或吞噬作用內化入胞，從而增強藥效［8-13］；另一方面，納米混懸劑稀釋后隱丹參酮處于溶解狀態，處方中大豆磷脂有助于促進藥物進入細胞［7］，而泊洛沙姆188 會影響腫瘤細胞轉運蛋白作用［14］，降低腫瘤細胞對胞內藥物的外排，從而增加藥物胞內蓄積。前期研究表明，泊洛沙姆188 具有逆轉耐藥、增加藥物藥效等作用［14-16］。因此，納米混懸劑不僅有助于解決隱丹參酮溶解度差的問題，而且可提高其藥效。