大孔吸附樹脂富集純化玳玳花總黃酮

侯夢陽 胡文忠?修志龍郝可欣于皎雪王澳盛張夢琦

（1.大連理工大學生物工程學院，遼寧大連 116024；2.大連民族大學生命科學學院，生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧大連 116600）

玳玳花為蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥花蕾，主要分布在熱帶及亞熱帶地區，其味苦，性平，功效強心、利尿、清血、化痰、疏肝和胃、理氣解郁等［1］，含有黃酮、強心苷、生物堿、揮發油、多糖類等化合物［2-3］，以黃酮為主，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、預防動脈粥樣硬化等活性［4-6］。Yang 等［7］對玳玳花總黃酮超聲提取工藝進行了研究；蘇浬［8］采用大孔樹脂層析法，在水提醇沉工藝的基礎上對該成分進行了純化。但Karimi 等［9］報道，水提法提取玳玳花總黃酮時提取率較低，而且在大孔吸附樹脂柱層析前要經過一步醇沉工藝，會導致其回收率降低。

大孔吸附樹脂具有理化性質穩定、純化工藝操作簡單、便于工業化生產等優點，被廣泛應用于藥材中總黃酮的分離純化，如紫菀［10］、鐵皮石斛［11］、淫羊藿［12］等，均取得了較好的效果。因此，本實驗將比較NKA-9、HPD100、HPD400、HPD600、AB-8、D101、X-5、DM301 大孔吸附樹脂對玳玳花總黃酮的吸附、解吸性能，應用吸附動力學、熱力學模型對吸附過程進行研究，再優化該成分富集純化工藝，旨在為其工業化開發利用提供理論依據。

1 材料

UV-2550 紫外可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；SHA-CA 往復式水浴振蕩器（金壇市順華儀器有限公司）。NKA-9、X-5、DM301、AB-8、D101、HPD100、HPD400、HPD600 大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。玳玳花采自云南省昆明市，經黑龍江中醫藥大學陳效忠副教授鑒定為柑橘屬植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥花蕾。蘆丁對照品（上海源葉生物科技有限公司）；氫氧化鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

2 方法

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 線性關系考察 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法［13］。吸取對照品溶液（稱取蘆丁對照品20 mg，40%乙醇定容至25 mL 量瓶中，質量濃度為0.8 mg／mL）150、300、450、600、750、900 μL，置于10 mL 量瓶中，加入5%NaNO2溶液300 μL，搖勻后靜置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液300 μL，搖勻后靜置6 min，加入4%NaOH 溶液2 mL，30% 乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min，在510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），蘆丁質量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為A＝10.957 4X-0.001 9（R2＝0.999 6），在12～72 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.1.2 提取液制備 將100 g 干燥藥材粉末（過30 目篩）用70%乙醇浸泡過夜后，在60 ℃下加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液后過濾，減壓濃縮至無醇味，蒸餾水定容至1 000 mL，即得（質量濃度為5.88 mg／mL），再用蒸餾水將其質量濃度分別稀釋至原有的5／6、4／6、3／6、2／6、1／6，即4.90、3.92、2.94、1.96、0.98 mg／mL。

2.1.3 精密度試驗 吸取“2.1.1”項下對照品溶液600 μL，按“2.1.1”項下方法在1 d 內測定6 次吸光度，測得其RSD 為0.51%，表明該方法日內精密度良好；同法連續測定吸光度3 d，每天1 次，測得其RSD 為0.87%，表明該方法日間精密度良好。

2.1.4 重復性試驗 吸取“2.1.2”項下5.88 mg／mL提取液600 μL，按“2.1.1”項下法測定6 次吸光度，測得其RSD 為0.74%，表明該方法重復性良好。

2.1.5 穩定性試驗 吸取“2.1.2”項下5.88 mg／mL提取液600 μL，于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.1”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.13%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 稱取蘆丁含量已知的“2.1.2”項下5.88 mg／mL 提取液6 份，每份600 μL，精密加入“2.1.1”項下對照品溶液400 μL，按“2.1.1”項下方法測定吸光度，計算回收率。結果，蘆丁平均加樣回收率為98.12%，RSD 為0.84%。

2.2 靜態吸附、解吸實驗

2.2.1 樹脂篩選 稱取預處理好的樹脂1 g（干重），置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入“2.1.2”項下5.88 mg／mL 提取液50 mL 后置于搖床中，在25 ℃下振蕩24 h（150 r／min）。達到吸附平衡后，用去離子水清洗樹脂，加入50 mL 95%乙醇解吸后置于搖床中，在25 ℃下振蕩24 h（150 r／min），測定溶液中總黃酮質量濃度，即為吸附平衡濃度。

2.2.2 吸附動力學研究 稱取預處理好的AB-8 樹脂1 g（干重），置于150 mL 具塞錐形瓶中，加入“2.1.2”項下5.88 mg／mL 提取液50 mL 后置于搖床中，在25 ℃下振蕩12 h（150 r／min），在吸附時間0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240 min 各取600 μL 吸附后的樣品溶液，測定t時刻總黃酮質量濃度Ct（mg／mL），計算吸附能力Qt（mg／g）、平衡吸附能力Qe（mg／g），公式分別為Qt ＝Vi（C0-Ct）、Qe＝Vi（C0-Ce）。其中，C0為總黃酮初始質量濃度，單位mg／mL；Ce為吸附平衡質量濃度，單位mg／mL；Vi為樣品體積，單位mL。

采用準一級動力學、準二級動力學、粒子擴散模型描述總黃酮吸附過程，分別為ln（Qe-Qt）＝-k1t +lnQe、其中，k1為準一級動力學速率常數，單位min-1；k2為準二級動力學速率常數，單位g／（g·min）；kd、Cd為粒子擴散速率常數，單位mg／（g·min1／2）、mg／g。

2.2.3 吸附熱力學研究 稱取預處理好的AB-8 樹脂1 g（干重），置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入“2.1.2”項下6 個質量濃度提取液各50 mL，在298.15、308.15、318.15 K 下振蕩（150 r／min），測定總黃酮平衡濃度Ce、Qe，繪制吸附等溫線，計算吸附熱力學參數。

采用Langmuir、Freundlich、Temkin 吸附等溫線模型描述吸附過程，分別為、Qe＝BTlnCe+BTlnKT。其中，Qe為平衡吸附能力，單位mg／g；Qm為理論最大吸附能力，單位mg／g；Ce為平衡質量濃度，單位mg／L；KL為Langmuir 常數，單位L／mg；KF為Freundlich 常數，單位［（mg／g）（L／mg）1／n］；BT、KT為Temkin 常數，單位J／mol、L／mg；1／n為Freundlich 經驗常數。

吸附熱力學函數包括吉布斯自由能變化（ΔG）、焓變（ΔH）、熵變（ΔS），分別為ΔG ＝-RTlnKeq、lnKeq＝-其中，R為理想氣體常數［8.314 J／（mol·K）］；T為絕對溫度，單位K；Keq為熱力學平衡常數，單位L／g。

2.3 動態吸附、解吸實驗 將預處理好的AB-8樹脂采用濕法裝入層析柱（16 mm×300 mm，1 BV＝20 mL），總黃酮粗提液以不同體積流量（2、3、4、5 BV／h）上柱，5 BV 蒸餾水緩慢洗脫以除去雜質，再取30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各10 BV，以2 BV／h 體積流量進行洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮質量濃度，考察乙醇體積分數對解吸率的影響。取最佳體積分數洗脫液，以不同體積流量（2、3、4、5 BV／h）洗脫，測定流出液中總黃酮質量濃度，考察上樣體積流量、上樣量，以及洗脫劑質量濃度、洗脫體積流量、用量等工藝參數對吸附、解吸性能的影響。

3 結果

3.1 樹脂篩選 圖1 顯示，AB-8、NKA-9、DM301、D101 樹脂對總黃酮的吸附能力較高，均高于80 mg／g；AB-8、DM301、D101 樹脂對總黃酮的解吸能力較高，均高于50 mg／g；AB-8 樹脂解吸率最高，HPD400 樹脂解吸率最小。最終，選擇AB-8 樹脂富集純化總黃酮。

圖1 總黃酮吸附能力、解吸能力、解吸率Fig.1 Adsorption capacities，desorption capacities and desorption rates of total flavonoids

3.2 靜態吸附動力學 吸附動力學是研究在特定初始濃度、溫度、壓力下吸附劑對吸附質的吸附速率，有助于實際操作中工藝參數的優化及加工設備的選擇［14］。圖2 顯示，AB-8 樹脂對總黃酮的吸附能力隨著時間延長而增加，在前60 min 更明顯，之后趨于緩慢，在120 min 時達到平衡。

動力學方程及相關參數見表1，可知準二級吸附動力學模型方程計算得到的理論平衡吸附量（103.092 8 mg／g）更接近實驗值（95.894 1 mg／g），能較好地描述總黃酮靜態吸附過程。

圖2 總黃酮靜態吸附動力學曲線Fig.2 Kinetic curve for static adsorption of total flavonoids

表1 總黃酮動力學方程及相關參數Tab.1 Kinetic equations and related parameters for total flavonoids

3.3 靜態吸附熱力學

3.3.1 吸附等溫線 對吸附等溫曲線的研究有助于探討吸附質和吸附劑之間的相互作用，從而優化操作參數，節約能源［15］。圖3 顯示，AB-8 樹脂對總黃酮的平衡吸附能力隨著其質量濃度升高而增加，在低質量濃度下更明顯，為4.90 mg／mL 時達到最大，故以其為上樣液質量濃度；Qe隨著溫度升高而下降，表明吸附為放熱過程。

等溫線方程及相關參數見表2，可知隨著溫度升高，KL、KF均減小，表明降低溫度有利于總黃酮吸附；0＜1／n＜1，表明該吸附過程容易進行［16］；與Freundlich、Temkin 模型比較，Langmuir 模型具有較高的R2，可較好地描述吸附過程。

圖3 總黃酮靜態吸附等溫線Fig.3 Isotherms for static adsorption of total flavonoids

3.3.2 吸附熱力學函數 以1／T為橫坐標（X），lnKeq為縱坐標（Y）進行擬合，得方程為Y ＝306.694 0X +1.514 2（R2＝0.991 8），再根據其斜率、截距分別計算ΔH、ΔS，結果見表3。由此可知，ΔG、ΔH均為負值，表明吸附為自發放熱過程［17］；ΔH絕對值小于40 kJ／mol，表明吸附為物理過程［18］；ΔS為正值，表明吸附為熵增過程，即AB-8 樹脂吸附總黃酮后，整個吸附系統的無序度增大。

表2 總黃酮等溫線方程及相關參數Tab.2 Isotherm equations and related parameters for total flavonoids

表3 總黃酮吸附熱力學參數Tab.3 Thermodynamic parameters for total flavonoids

3.4 動態吸附、解吸實驗

3.4.1 泄露曲線分析 一般而言，流出液中目標物濃度達到上樣液濃度的10%時，即可認為達到泄露點［19］。取“2.1.2”項下4.90 mg／mL 提取液，以不同體積流量（2、3、4、5 BV／h）通過樹脂柱，動態泄露曲線見圖4，可知在低體積流量下AB-8 樹脂對總黃酮具有較強的吸附能力，即有利于該成分充分吸附，故本實驗選擇2 BV／h 作為上樣體積流量，達到泄漏點時的上樣量為7 BV。

圖4 總黃酮動態泄露曲線Fig.4 Dynamic leakage curves for total flavonoids

3.4.2 乙醇體積分數對洗脫效果的影響 先用5 BV蒸餾水緩慢洗脫以除去雜質，再取30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 乙醇各10 BV，以2 BV／h 體積流量進行洗脫，收集洗脫液，測定總黃酮質量濃度，結果見圖5。由此可知，隨著乙醇濃度體積分數增加，解吸率不斷升高，為70%時達到最大值86.26%，但之后反而開始下降，故選擇70%作為乙醇體積分數。

3.4.3 解吸曲線分析 先用5 BV 蒸餾水洗脫除去水溶性雜質，再用70% 乙醇以不同體積流量（2、3、4、5 BV／h）進行洗脫，每過一定時間收集洗脫液，計算解吸率，結果見圖6。由此可知，隨著體積流量增加，解吸效果降低，這是因為體積流量較高時會導致洗脫劑與AB-8 樹脂的接觸時間變短，不能充分洗脫被吸附的總黃酮，而且2、3 BV／h的解吸效果無明顯差異，為了提高操作效率，本實驗選擇3 BV／h 作為解吸體積流量，此時解吸液用量為6 BV。

圖5 乙醇體積分數對總黃酮解吸率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption rate of total flavonoids

圖6 總黃酮動態解吸曲線Fig.6 Dynamic desorption curves for total flavonoids

3.5 驗證試驗 取“2.1.2”項下4.90 mg／mL 提取液7 BV，以2 BV／h 體積流量緩慢加到AB-8 樹脂柱中，待吸附完全后用5 BV 蒸餾水洗脫除去水溶性雜質，再取6 BV 70%乙醇，以3 BV／h 體積流量進行洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，測得總黃酮純度由9.87%升高至36.75%，回收率為83.17%，表明該純化工藝穩定可行。

4 討論

大孔吸附樹脂是將吸附性、篩選性相結合的分離材料，其吸附能力由孔徑、比表面積、表面極性等因素所決定，作用力主要包括范德華力和氫鍵［20］。本實驗發現，AB-8 大孔吸附樹脂對玳玳花總黃酮吸附、解吸性能最強，與蘇浬［8］報道一致，它具有相對較大的比表面積，有利于該成分吸附，并且相對較大的孔徑也有利于其解吸。

AB-8 大孔吸附樹脂對玳玳花總黃酮的吸附過程最符合二級動力學模型，整個吸附過程被分為2 個階段，擬合曲線均未通過原點，表明顆粒內擴散不是唯一控制吸附過程的步驟，在一定程度上也受到邊界層擴散的影響［21］，同時也符合Langmuir等溫線模型，屬于單分子層吸附。經過1 次層析后，玳玳花總黃酮純度從9.87% 提高至36.75%，回收率為83.17%，表明AB-8 大孔吸附樹脂可有效富集純化該成分，有望應用于其工業化制備中。