HPLC-DAD 法同時測定益腎健骨丸中5 種成分

王雪梅，劉校栓，王寶才，李喜香，李盛華，戴 剛

（甘肅省中醫院，甘肅蘭州 730000）

益腎健骨丸是甘肅省中醫院的院內制劑，由當歸、枸杞子、蘇木、丹參、白芍、生地黃、秦艽、女貞子、土鱉蟲等18 味中藥組成，方中酒茱萸、鎖陽溫補腎陽；枸杞子、女貞子、生地黃滋補腎陰，填精益髓；龍骨、牡蠣平肝潛陽，收斂固澀而益腎；蘇木、丹參、土鱉蟲活血化瘀，通絡止痛；秦艽祛風通絡；當歸、杭白芍平肝健脾養血，諸藥合用，共奏補益肝腎、固本強筋、壯骨蠲痹功效，用于治療腎虛型膝骨性關節炎，療效顯著［1］。

復方制劑藥效是組方藥物多成分共同作用的結果，僅靠單一指標含量難以客觀評價其質量，而多指標測定更為適合［2］。前期有報道采用HPLC 法對芩龍降壓膠囊中龍膽苦苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷，以及益經顆粒中阿魏酸、芍藥苷、毛蕊花糖苷進行定量分析［3-4］，故本實驗采用HPLC-DAD 法同時測定益腎健骨丸中龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷的含量，以期為該制劑質量標準的提高和完善提供理論依據和實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies 公司）；360EP 型、125SM 型電子天平（德國Satorius 公司）；LA753 型實驗室純化水機（上海威立雅水務設備安裝工程有限公司）；SB-320DTDN 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 龍膽苦苷（批號110770-201716，純度97.1%）、馬錢苷（批號111640-201706，純度99.2%）、芍藥苷（110736-201337，純度95.7%）、阿魏酸（批號110773-20614，純度99.0%）、毛蕊花糖苷（111530-201310，純度92.5%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。益腎健骨丸（40 g／瓶，批號191201、191202、191203），由甘肅省中醫院制劑中心制備。甲醇為色譜純（天津市大茂化學試劑廠）；磷酸、甲醇等試劑為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（LA753 型實驗室純化水機制備）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷對照品適量，甲醇制成每1 mL 分別含五者1.272、1.180、1.605、0.413、1.155 mg 的貯備液，精密吸取適量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（每1 mL 分別含五者381.60、35.40、240.75、12.375、34.65 μg）。

2.1.2 供試品溶液 取丸劑適量，研細，精密稱取5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質量，密塞，超聲（220 W、40 kHz）處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按照處方工藝，制得缺秦艽、山茱萸、白芍、當歸、生地黃的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～20 min，14% A；20～30 min，14%～20%A；30～44 min，20%～22%A；44～54 min，22%～32%A；54～66 min，32%～40%A；66～70 min，40%～42% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長230 nm（0～55 min，龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷）、330 nm（55～70 min，阿魏酸、毛蕊花糖苷）；進樣量10 μL。

2.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分均能達到基線分離（分離度＞1.5），陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下貯備液適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成分別含龍膽苦苷 63.6、127.20、254.40、381.60、508.80、636.00 μg／mL，馬錢苷5.90、11.80、23.60、35.40、47.20、59.00 μg／mL，芍藥苷40.125、80.25、160.50、240.75、321.00、401.25 μg／mL，阿魏酸 2.062 5、4.125、8.250、12.375、16.500、20.625 μg／mL，毛蕊花糖苷5.775、11.55、23.10、34.65、46.20、57.75 μg／mL的對照品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.4”項下高、中、低質量濃度對照品溶液適量，在“2.2”項色譜條件下各進樣測定6 次，測得高質量濃度下龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為0.45%、0.86%、0.72%、0.94%、1.07%，中質量濃度下分別為0.98%、1.23%、1.09%、1.28%、1.36%，低質量濃度下分別為1.67%、1.88%、1.54%、1.92%、2.03%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取丸劑（批號191201）適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為0.65%、1.48%、0.87%、1.76%、0.94%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批丸劑（批號191201）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為 1.28%、2.23%、2.52%、1.07%、2.06%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的丸劑（批號191201）適量，研細，精密稱取粉末2.5 g，共6 份，置于具塞錐形瓶中，按100%水平精密加入“2.1.1”項下對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

2.9 樣品含量測定 取3 批丸劑適量，每批3 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含量測定結果（μg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g， n＝3）

3 討論

秦艽中含有大量龍膽苦苷，具有保肝、益肝、抗炎鎮痛等多種藥理作用［5］；酒茱萸中馬錢苷在抗血栓、抗炎、抗氧化應激損傷等方面都有顯著活性［6］；芍藥苷作為白芍主要有效成分，具有補血、抗抑郁、鎮痛、解痙等功效［7］；當歸成分阿魏酸具有抗血小板聚集、增強前列腺素活性、鎮痛緩解血管痙攣等活性［8］；毛蕊花糖苷是熟地黃特有藥效成分，具有很強的抗炎、抗氧化作用，并可調節骨代謝［9-10］。因此，本實驗選擇龍膽苦苷、馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷作為含量測定指標成分。

5 種成分紫外吸收波長的差異較大［11］，分別為龍膽苦苷254 nm、馬錢苷240 nm、芍藥苷230 nm、阿魏酸316 nm、毛蕊花糖苷334 nm。為了使這些成分在一次進樣中同時得到測定，本實驗設定230、330 nm 檢測通道，可有效得到分離。

本實驗首先考察了甲醇-0.1% 磷酸、甲醇-0.2%磷酸，最終確定后者作為流動相，此時各成分分離效果最佳，峰型較好。再考察了柱溫25、30 ℃，發現龍膽苦苷、馬錢苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷在2 種柱溫下的分離效果和峰型均較好，但芍藥苷僅在25 ℃下峰型理想，故選擇柱溫為25 ℃。