三七總皂苷對非酒精性脂肪肝大鼠的改善作用及對NO／iNOS／NF-κB通路的影響

馮曉異，何朋倫，趙 微，姚 政，陳文慧

（云南中醫藥大學，云南昆明 650500）

非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史，以肝細胞內甘油三酯蓄積過多、彌漫性肝細胞脂肪變性為主要病理特征的臨床綜合征［1］，屬于代謝應激性肝損傷疾病，發病與胰島素抵抗、遺傳易感性密切相關，炎癥因子失衡是關鍵環節［2］。NF-κB 信號通路是炎癥信號轉導途徑中的主要通路之一，可上調編碼炎癥介質和細胞因子的促炎基因表達，從而進一步激活誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等相關酶類及血管細胞黏附分子，炎癥反應得以級聯放大［3-5］，同時iNOS 的激活進一步釋放大量NO，后者是細胞間信息交換的重要載體之一，廣泛參與生理功能的調節和病理過程的發生［6-7］。

三七為五加科植物，以干燥根、根莖入藥，其味甘、微苦，屬云南道地藥材，也是活血祛瘀、通脈活絡的常用臨床用藥，在治療血證，尤其是瘀血方面有“金不換”之稱，其主要成分三七總皂苷是關鍵藥效物質［8-10］，具有影響炎性免疫反應的作用［11-13］。本實驗在前期研究［14］基礎上，進一步探討在非酒精性脂肪肝病理進展中三七總皂苷對血清轉氨酶、血脂生化指標、肝組織中NO 和iNOS 表達的影響，以及對iNOS／NO／NF-κB 通路的調節作用，并分析各項檢測指標與非酒精性脂肪肝進展及該成分作用之間的關系，以期為深入研究相關可能機制奠定理論基礎。

1 材料

1.1 動物 96 只SPF 級SD 雄性大鼠，體質量（200±20）g，由四川省成都達碩生物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（川）2014-23，飼養于云南中醫藥大學SPF 實驗動物中心。飼養環境符合清潔級動物環境標準，室內安靜，自然采光，通風良好，溫度濕度保持恒定。

1.2 試劑與藥物 三七總皂苷（批號TB20171210，西安天寶生物科技有限公司，純度＞95%）。0.9%氯化鈉溶液（批號SO97A62，中國大家制藥有限公司）；高密度脂蛋白檢測試劑盒（A112-1，批號20160301）、低密度脂蛋白檢測試劑盒（A113-1，批號20160219）、甘油三酯檢測試劑盒（A110-1，批號20160525）、總膽固醇檢測試劑盒（A111-1，批號20160522）、ALT 檢測試劑盒（A009-2，批號 20160622）、AST 檢測試劑盒（A010-2，批號20160625）（南京建成生物科技有限公司）；總NO 檢測試劑盒（KGE001，批號335566，美國R＆D 公司）；一氧化氮合成酶檢測試劑盒（KA1634，批號62316，美國Abnova 公司）；iNOS、NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、p-IkBα 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 采用88%普通飼料加10%豬油、2%膽固醇的高脂飼料喂養SD 大鼠，建立高脂性早期脂肪肝模型，并按非酒精性脂肪肝病診療指南（2010 年修訂版）病理學診斷標準進行評價。

2.2 分組與給藥 96 只大鼠按隨機數字表法分為6 組，每組16 只，分別為空白組（普通飼料飼養，生理鹽水灌胃給藥）、模型組（高脂飼料飼養，生理鹽水灌胃給藥）、三七總皂苷低劑量組（高脂飼料飼養，4.5 mg／kg 三七總皂苷灌胃給藥）、三七總皂苷中劑量組（高脂飼料飼養，9 mg／kg 三七總皂苷灌胃給藥）、三七總皂苷高劑量組（高脂飼料飼養，18 mg／kg 三七總皂苷灌胃給藥）、⑥辛伐他汀組（高脂飼料飼養，2 mg／kg 辛伐他汀灌胃給藥），各組給藥容量均為10 mL／kg，每天1 次，連續12 周。于給藥第8、12 周末取材（每組8 只），進行相關指標檢測，藥物水平依據動物實驗用藥公式計算，即大鼠給藥量＝（6.3×每天成人給藥量）×大鼠體質量（平均200 g）／成人體質量（60 kg）。

2.3 大鼠肝組織病理形態觀察 取材前大鼠禁食不禁水12 h，取材當日迅速打開麻醉后大鼠的胸腔，取出肝組織，于最大葉上取約1 cm3大小置于4%多聚甲醛中保存，制作石蠟切片用于HE 染色，其余肝組織于-80 ℃下保存備用。

2.4 大鼠血清生化指標檢測 各組大鼠麻醉后腹主動脈采血，4 ℃下3 000 r／min 離心15 min 后，取上清液，根據羅氏生化分析儀操作步驟檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平。肝組織勻漿后，5 500 r／min 離心15 min，取上清液檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。

2.5 大鼠肝組織NO、iNOS 表達檢測 采用ELISA 法。將肝臟置于5 倍量組織勻漿緩沖液（10 倍體積RIPA 裂解液+1／100 體積蛋白酶抑制劑）中，4 ℃下勻漿，勻漿液5 500 r／min 離心15 min，取上清液，按ELISA 試劑盒說明書要求進行檢測。

2.6 大鼠肝組織iNOS 相關表達檢測 采用免疫組化法。按“2.3”項下方法制備石蠟切片后進行烤片、水化、抗原修復，再滴加iNOS 抗體，DAB 顯色，光學顯微鏡拍照，通過Image J 軟件對圖片進行iNOS 表達陽性細胞占比計算。

2.7 大鼠肝組織NF-κB 信號通路相關蛋白表達檢測 取大鼠肝臟組織約20 mg，按1∶10 比例加入RIPA 強效裂解液，按1∶100 比例加入蛋白酶抑制劑，4 ℃下組織勻漿，勻漿液12 000 r／min 離心10 min，取上清液，BCA 法進行蛋白定量，蛋白變性后取30 μg 進行SDS-PAGE，轉膜至NC 膜，4 ℃下孵育一抗過夜，PBST 洗膜后室溫下孵育二抗1 h，PBST 洗膜，ECL 顯色后在TANON 凝膠成像儀上曝光檢測條帶，通過Image J 軟件進行條帶灰度分析。

2.8 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，計量資料符合正態性以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法；不符合正態性，則進行非參數檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 三七總皂苷對大鼠肝組織細胞形態的影響

3.1.1 模型組 給藥8 周末，大鼠肝組織每單位面積視野下超過1／3 的肝細胞出現脂肪變性，多數肝細胞內出現脂滴，但尚未融合成大的脂肪空泡，炎癥程度較輕。給藥12 周末，模型組大鼠肝細胞出現大量脂肪空泡，將細胞核擠向胞膜一側，大量肝細胞出現明顯氣球樣變，多數視野下肝索結構難以辨認，并伴隨明顯的炎細胞浸潤和肝細胞壞死情況。見圖1。

3.1.2 給藥組 給藥8 周末，辛伐他汀組大鼠未觀察到脂肪變性，肝索排列規則，肝小葉結構正常；三七總皂苷高劑量組大鼠偶見個別肝細胞存在脂肪空泡，肝細胞結構、肝索排列、肝小葉結構無明顯異常；三七總皂苷中、低劑量組大鼠有散在的肝細胞中出現脂滴的聚集，中劑量組出現脂滴的程度明顯少于低劑量組。給藥12 周末，辛伐他汀組、正常組大鼠無明顯差異，三七總皂苷高劑量組大鼠雖然大部分細胞出現明顯的細胞水腫，但脂變、炎癥程度都低于中、低劑量組，三七總皂苷低劑量組脂變程度和炎癥程度最高。見圖1。

圖1 第8、12 周各組大鼠肝組織病理形態（HE，10×40）Fig.1 Pathological morphologies of rat liver tissues in various groups in the 8th and 12th weeks（HE，10×40）

3.2 三七總皂苷對大鼠血清ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平的影響 給藥8 周末，與模型組比較，各給藥組大鼠血清ALT、TC、TG、LDL 水平降低（P＜0.05），除三七總皂苷高劑量組外各給藥組AST 水平降低（P＜0.05），除辛伐他汀組外各給藥組HDL 水平降低（P＜0.05）。給藥12 周末，與空白組比較，模型組ALT、AST、LDL 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組ALT、AST、TC、TG、LDL 水平降低（P＜0.05），除三七總皂苷低劑量組外各給藥組HDL 水平無明顯變化（P＞0.05）；除空白組外，各組HDL 水平呈下降趨勢，以模型組、辛伐他汀組更明顯（P＜0.05）；各組LDL 水平呈上升趨勢，以模型組更明顯（P＜0.01）；與同一時間點模型組比較，各給藥組LDL水平降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 第8、12 周各組大鼠血清生化指標Fig.2 Rat serum biochemical indices in various groups in the 8th and 12th weeks

3.3 三七總皂苷對大鼠肝組織NO、iNOS 表達的影響

3.3.1 NO 表達 給藥8 周末，與模型組比較，辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組NO 表達降低（P＜0.01）。給藥12 周末，與模型組比較，辛伐他汀組及三七總皂苷中、高劑量組NO 水平降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 第8、12 周大鼠肝組織NO 表達Fig.3 NO expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks

3.3.2 三七總皂苷對大鼠肝組織iNOS 表達的影響 給藥8 周末，與模型組比較，辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組iNOS 表達降低（P＜0.05），以三七總皂苷高劑量組更明顯（P＜0.01）。給藥12 周末，與模型組比較，辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組iNOS 表達降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 第8、12 周大鼠肝組織iNOS 表達Fig.4 iNOS expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks

3.3.3 三七總皂苷對大鼠肝組織iNOS 相對表達的影響 模型組大鼠iNOS 陽性細胞數量從第8 周的（4.89±1.04）% 升高到12 周的（5.57±0.44）%，辛伐他汀組從（0.75±0.03）% 升高到（2.89±1.60）%，三七總皂苷低、中、高劑量組分別從（1.20±0.26）%、（1.69±0.22）%、（2.21±0.28）%升高到（1.40±0.08）%、（1.73±0.51）%、（3.17±0.96）%；與模型組比較，各給藥組iNOS 表達降低（P＜0.01）。見圖5。

3.4 三七總皂苷對大鼠肝組織NF-κB、p-NF-κB、IKKα、p-IKKα、IkBα 蛋白表達的影響 給藥12 周末，與模型組比較，辛伐他汀組、三七總皂苷各劑量組NF-κB 蛋白表達及磷酸化水平降低（P＜0.05）；辛伐他汀組IKKα 蛋白表達及磷酸化水平降低（P＜0.05）；三七總皂苷中、高劑量組IKKα磷酸化水平降低（P＜0.05）；除三七總皂苷低劑量組外，各給藥組IκBα 蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖6。

圖5 第8 周、12 周大鼠肝組織iNOS 相對表達Fig.5 iNOS relative expressions in rat liver tissues in the 8th and 12th weeks

圖6 第12 周大鼠肝組織NF-κB、IKKα、IκBα 蛋白表達Fig.6 Protein expressions of NF-κB，IKKα and IκBα in rat liver tissues in the 12th weeks

4 討論

非酒精性脂肪肝是一種代謝應激性肝損傷疾病，包括非酒精性單純性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝細胞癌［15］。中醫認為，肝郁脾虛是非酒精性脂肪肝發生基礎，痰濁瘀毒則為其主要病理因素，痰濕淤血濕交阻互結，肝臟脈絡阻遏，從而形成該疾病，祛痰化瘀是治療首要目標。三七在治療血證，尤其是淤血方面的獨特作用，讓該藥材在臨床時被廣泛使用，對其作用機理的深入闡釋將為相關藥物的合理使用奠定理論基礎。

機體受到來自內部或外部的刺激時，會產生炎癥反應，其適度時在一定程度上可起到保護機體的作用，但長期、劇烈的炎癥會參與多種疾病的病理進程［16］，誘導產生大量iNOS，可很快從轉錄水平上調免疫細胞或其他內源免疫反應組織的活性，進一步釋放NO［17］，后者與O2-結合后生成一種更強的氧化劑ONOO-，導致自由基反應加劇、細胞損傷。在病理條件下，iNOS 強表達是臟器損傷和加重的重要原因，同時NO 可彌散入細胞抑制三羧酸循環，抑制線粒體呼吸鏈上某些限速酶，干擾能量代謝，減少ATP 合成，加劇組織損傷。炎癥過程中NF-κB 處于活化狀態，從而促使炎癥基因表達上調，激活iNOS 等相關酶類及血管細胞黏附分子，使炎癥反應級聯放大，其活化二聚體可易位進入細胞核內與靶基因發生特異性結合，從而調控NO 的生成、細胞因子表達和釋放［18-19］。

本實驗發現，高脂飼料飼養8 周末模型組大鼠肝臟已產生脂肪代謝障礙，而各給藥組未觀察到脂肪變性及結構異常，其中三七總皂苷僅中、低劑量新出現脂滴聚集，并體現出一定的量效關系；12 周末，模型組大鼠肝細胞呈現明顯的炎細胞浸潤和肝細胞壞死情況，而各給藥組能顯著改善肝細胞的形態，抑制炎性發生，阻止細胞壞死；辛伐他汀、三七總皂苷各劑量組大鼠血清AST、ALT、LDL-C、TC、TG 水平顯著下調（P＜0.05），其中大部分指標體現了量效關系；三七總皂苷各劑量組對肝組織NO、iNOS 水平及NF-κB 信號通路相關蛋白表達有調節作用，印證了該成分對非酒精性脂肪肝大鼠炎癥相關因子的抑制作用，從而可發揮緩解炎癥反應、保護肝臟的活性。

綜上所述，在非酒精性脂肪肝的形成及其進展過程中，三七總皂苷可有效降酶降脂，減輕炎癥，改善肝臟功能和炎癥反應，其機制可能與下調NO／iNOS／NF-κB 信號通路相關蛋白表達有關。