補虛解毒化瘀方對單側輸尿管梗阻大鼠健側腎臟腎小球細胞增殖的抑制作用

張雨軒，馬雪蓮，楊漢繼，趙綺悅，高曉萌，許慶友?

（1.河北中醫學院研究生學院，河北石家莊 050091；2.河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室，河北石家莊 050091）

我國慢性腎臟病的發病率不斷上升［1］，由梗阻性腎病導致的腎功能衰竭發病率也有明顯升高的趨勢。單側腎梗阻引起慢性腎衰竭的機制尚不明確，前期研究發現，單側輸尿管梗阻可誘導健側腎臟細胞增殖，并隨著時間的延長發生腎臟纖維化［2］。

近幾年來，中藥復方、單味藥及提取物在治療腎小球硬化、延緩腎功能衰竭方面取得了許多新進展［3-5］，但對單側腎臟損傷誘導慢性腎衰竭的干預機制尚不明確。因此，本實驗觀察補虛解毒化瘀方延緩梗阻性腎病健側腎小球硬化的作用機制，以期為相關臨床治療提供科學依據。

1 材料

1.1 動物 清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠40 只，4 周齡，體質量（200±10）g，購于河北醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK（冀）2013-1-003。隨機分為假手術組、模型組、依普利酮組、中藥組，每組10 只，適應性喂養1 周后進行實驗。

1.2 藥物 補虛解毒化瘀方組方藥材為生黃芪20 g，地龍、醋鱉甲、赤芍、黃芩、金銀花各10 g，均通過廣東一方制藥公司制成免煎顆粒。依普利酮購于美國輝瑞制藥公司。飼料經美國Research Diets 公司加工，由東京大學Tatsuo Shimosawa 教授惠贈。

1.3 試劑 誘導因子1α（HIF-1α）抗體（批號GR194781-9）、GAPDH 抗體（批號10494-1-AP）（英國Abcam 公司）；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（單克隆抗體，美國Proteintech 公司，批號10205-2-AP）；轉化生長因子（TGF-β1）抗體（批號G58021）、β-Actin 抗體（批號XS20170612031）（美國Bioworld Technology 公司）；免疫組化試劑盒（北京中衫金橋有限公司，批號K186621D）；脫脂奶粉（美國BD 公司，批號8064872）。

1.4 儀器 電泳儀及電泳槽（北京六一公司）；Semi-Day 半干轉膜儀（美國 Bio-Rad 公司）；DP72-CCD、BX53 病理圖文拍照系統（日本Olympus 公司）；RM 2245 石蠟切片機（德國Leica上海分公司）；1-15K 高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；近紅外成像掃描儀（美國 LI-COR Biosciences 公司）。

2 方法

2.1 造模 除假手術組外，其余各組大鼠結扎單側輸尿管，水合氯醛麻醉后于左側中腹部切開，游離左側輸尿管，分別在腎盂處、輸尿管上1／3 處用絲線結扎，在結扎線之間切斷輸尿管，逐層縫合腹壁皮膚［6］；假手術組僅游離左側輸尿管但不結扎離斷，輕輕撥動腸管后縫合皮膚。術后1 d，依普利酮組給予含藥混合飼料喂養（100 mg／kg）［7］；中藥組參照《實驗動物學》［8］給予免煎顆粒，按1.92 g／kg（相當于11.7 g／kg 生藥量）劑量加到3 mL蒸餾水中，每天灌胃1 次。

2.2 標本收集 藥物干預10 d 后處死大鼠，留取健側腎臟，一部分腎組織用4%多聚甲醛固定后制備常規石蠟切片，用于免疫組織化學染色；其余組織于-70 ℃下保存，用于分子生物學檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 腎組織損傷 大鼠腎組織進行HE 染色后，在普通光鏡下觀察。為了確定腎小球的損傷程度，參照Purkerson 等［9］對腎小球病變組織學的分級標準分為（1）0 級，無任何病變；（2）Ⅰ級，系膜基質增多，伴輕度系膜細胞增生；（3）Ⅱ級，系膜區擴大明顯，伴血管袢階段硬化和塌陷；（4）Ⅲ級，血管節段硬化，伴血管袢明顯塌陷；（5）Ⅳ級，腎小球硬化，伴透明病變，每張切片觀察20 個腎小球，歸于上述5 個等級，計算各等級腎小球所占比例，計算病理積分，進行半定量分析。

2.3.2 膠原纖維 大鼠腎組織進行Sirius red 染色后，在普通光鏡下觀察，以紅色膠原沉積為陽性信號。通過Image Proplus 多媒體彩色病理圖像分析軟件進行分析，計算腎小球膠原沉積面積與腎小球總面積的比值，取平均值。

2.3.3 HIF-1α、PCNA 相對表達 采用免疫組織化學法。HIF-1α 免疫染色評分為陽性細胞范圍與染色強度之和，陽性細胞范圍≤25% 為0 分，26%～50%為1 分，51%～75%為2 分，76%～100%為3 分；染色強度0 分為陰性著色，1 分為淡黃色，2 分為淺褐色，3 分為深褐色，每張切片觀察20 個腎小球并分別計分，PCNA 檢測腎小球陽性細胞占腎小球細胞總數的比例，進行半定量分析。

2.3.4 HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達 采用免疫蛋白印跡法。提取大鼠腎皮質蛋白，BCA 測定濃度后在95 ℃下變性，取30～60 μg 進行SDSPAGE 凝膠電泳后轉至PVDF 膜上，BSA 封閉1 h，加入一抗（1∶200～1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，TBST 清洗3 次，每次8 min，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次8 min，TBS 清洗5 min，紅外激光成像系統掃描，所得結果以內參校正。

2.4 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較先采用方差分析，再采用Tukey 檢驗（均為雙側檢驗）。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠腎組織病理變化 HE 染色顯示，假手術組大鼠腎小球結構無異常，血管袢開放良好；模型組大鼠腎小球體積增大，系膜細胞增殖明顯（P＜0.05）；依普利酮、中藥組大鼠細胞增殖較模型組減輕（P＜0.05）。Sirius red 染色顯示，模型組膠原沉積多于假手術組（P＜0.05），依普利酮、中藥組膠原沉積更少（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠健側腎臟病理變化及HIF-1α、PCNA 相對表達（×400）Fig.1 Renal pathological changes and HIF-1α，PCNA relative expressions in contralateral kidneys of rats in various groups（×400）

表1 各組大鼠健側腎臟膠原沉積（， n＝6）Tab.1 Collagen deposition of contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

表1 各組大鼠健側腎臟膠原沉積（， n＝6）Tab.1 Collagen deposition of contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

注：與假手術組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.2 大鼠腎組織HIF-1α、PCNA 相對表達 假手術組大鼠HIF-1α 僅在腎小管呈弱表達，主要見于細胞漿內；模型組大鼠HIF-1α 相對表達增強（P＜0.05），可見于腎小管及腎小球，小球內大量細胞核著色，呈棕色黃染顆粒；中藥組、依普利酮組大鼠腎小管內少量著色，主要表達在細胞漿內，HIF-1α 相對表達低于模型組（P＜0.05）。見圖1、表2。

假手術組大鼠PCNA 陽性細胞較少，可見于腎小管及腎小球；模型組大鼠腎小球陽性細胞增多（P＜0.05）；中藥組、依普利酮組大鼠PCNA 陽性細胞少于模型組（P＜0.05）。見圖1、表3。

表2 各組大鼠健側腎臟HIF-1α 相對表達（， n＝6）Tab.2 Relative expressions of HIF-1α in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

表2 各組大鼠健側腎臟HIF-1α 相對表達（， n＝6）Tab.2 Relative expressions of HIF-1α in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

注：與假手術組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

表3 各組大鼠健側腎臟PCNA 相對表達（， n＝6）Tab.3 Relative expressions of PCNA in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

表3 各組大鼠健側腎臟PCNA 相對表達（， n＝6）Tab.3 Relative expressions of PCNA in contralateral kidneys of rats in various groups（， n＝6）

注：與假手術組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

3.3 大鼠腎組織HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達 模型組HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達高于假手術組（P＜0.05），中藥組、依普利酮組三者蛋白表達低于模型組（P＜0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠健側腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達Fig.2 Protein expressions of HIF-1α，TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats

表4 各組大鼠健側腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達（， n＝3）Tab.4 Protein expressions of HIF-1α，TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats（， n＝3）

表4 各組大鼠健側腎臟HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達（， n＝3）Tab.4 Protein expressions of HIF-1α，TGF-β1and PCNA in contralateral kidneys of rats（， n＝3）

注：與假手術組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05。

4 討論

大多數梗阻性腎病如能及時發現并解除梗阻、引流腎臟尿液，則可部分或完全恢復，但部分患者腎功能仍然無法恢復，甚至繼續惡化，進展為慢性腎衰竭，故健側腎臟受損可能是發生該疾病的重要原因。受損的腎臟可以表現為腎間質纖維化、腎小球硬化，梗阻性腎病以間質纖維化關注主多，而對腎小球尤其是健側（對側）腎臟關注不夠，腎間質纖維化的改變與小管上皮細胞、間質細胞、浸潤而來的多種炎性細胞相關，腎小球硬化的主要病理特征為系膜細胞增殖和細胞外基質的過度積聚［10］。

大量研究表明，腎小球系膜細胞是導致Ⅰ型膠原等系膜基質成分不斷增加的主要效應細胞，腎小球固有細胞增殖及細胞外基質（ECM）異常積聚是導致腎小球硬化的重要因素，故有效地抑制腎小球細胞增殖對延緩腎小球硬化有重要意義。細胞增殖與增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）密切相關，后者是一種僅出現在增殖狀態細胞核內的酸性蛋白質，故其表達增強表明細胞正處于增生狀態。研究發現，轉化生長因子β1（TGF-β1）與腎小球硬化發生發展密切相關，它是一個多功能細胞因子，可促進細胞增殖、調節ECM 積聚［10］，被公認為是腎小球硬化的治療靶標［11］。在過去，腎臟缺氧被認為是纖維化過程的結果而不是誘因，但最近研究表明缺氧可能是腎臟疾病進展的早期潛在的起始事件［12-14］，炎癥反應、活性氧（ROS）均可調節缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達，細胞在增殖過程中消耗大量氧氣也可激活［15］，它是細胞適應缺氧的關鍵轉錄調節因子，由ɑ、β 亞基組成，可刺激缺氧基因產物的表達，促進腎纖維化和慢性腎病進展［16］，慢性缺氧可通過抑制其降解來增加蛋白累積，從而使其高表達，并可上調TGF-β1來促進細胞增殖。因此，慢性缺氧可能是引起腎小球硬化的重要原因。

慢性腎臟病根據其臨床表現和發病特點，歸屬于中醫的“水腫”“關格”“癃閉”等范疇。目前普遍認為，腎小球硬化是虛實夾雜、本虛標實之證，本虛表現為脾腎虧虛，標實表現為瘀血、水腫、濁毒等，正氣虧虛是腎小球硬化的根本原因，瘀血是加重腎小球硬化的重要因素。遵循中醫“既病防變”理論，在慢性腎臟病的治療過程中不僅要關注已經發生的疾病，對于尚未發生或已經發生但未深入的病變更要重視。對于梗阻性腎病而言，不僅要研究梗阻側腎臟病變，還要考察對側腎臟的病理生理變化。

現代研究表明，中藥對防治腎小球硬化有獨特療效。例如，黃芪含藥血清可抑制大鼠系膜細胞增殖［17］，其總皂苷能抑制高糖誘導下系膜細胞的過度增殖［18］；芪歸益腎方可通過調節凝血酶調節蛋白來有效延緩單側輸尿管梗阻小鼠腎臟纖維化［19］；丹參注射液可下調TGF-β1表達，提高活性氧水平，延緩腎小球硬化［20］；地龍能通過抗氧化等途徑抑制腎小球系膜細胞增殖，降解細胞外基質，防止腎小球硬化發生［21］。

本實驗通過HE 染色來觀察大鼠腎組織形態變化，Sirius red 染色來觀察腎組織膠原沉積，免疫印跡法來檢測HIF-1α、TGF-β1、PCNA 蛋白表達，考察補虛解毒化瘀方對單側輸尿管梗阻健側腎臟的干預作用。結果表明，給藥10 d 后模型組大鼠腎小球膠原沉積較假手術組明顯增多；與模型組比較，補虛解毒化瘀方組可減少大鼠腎小球膠原沉積，延緩其硬化進程，HIF-1α、TGF-β1蛋白表達明顯降低，提示該方延緩腎小球硬化的作用機制可能是通過改善缺氧、抑制HIF-1α 表達、下調TGFβ1蛋白表達、抑制細胞過度增殖所致。方中黃芪功效補氣行血、扶正祛邪，赤芍功效活血利水，地龍、醋鱉甲功效化瘀通絡，黃芩、金銀花功效清熱解毒，諸藥相伍，共奏益氣活血化瘀通絡、標本兼顧的作用。

綜上所述，本實驗從分子蛋白水平證實補虛解毒化瘀方是抑制單側輸尿管梗阻誘導健側腎小球硬化的有效中藥制劑，可為相關臨床研究提供依據，也為該方有效成分的進一步開發應用提供參考。