加味益氣通玄方對大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用

彭 艷，白 雪，馮文戰，劉 祎，郭 佳，高 立

（1.西南醫科大學附屬中醫醫院全科醫學科，四川瀘州 646000；2.西南醫科大學附屬中醫醫院心腦病科，四川瀘州 646000）

缺血性卒中是由各種原因導致局部腦組織血液供應障礙，造成神經元損傷、神經功能缺損。緩解由腦缺血引起神經系統損傷的主要方法是迅速恢復缺血區域的血流［1］，但血液再灌注會增加興奮性氨基酸、氧自由基、細胞內Ca2+產生，均可對腦組織造成額外的損傷，即腦缺血再灌注損傷，其發生發展涉及多個信號通路的變化。其中，磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydrxy kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）-內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信號通路廣泛參與調節細胞活化，炎癥反應、細胞凋亡，在腦缺血再灌注損傷中發揮保護作用［2-3］。

研究表明，中藥及其單體可通過多種途徑作用于多個靶點，從而防治腦缺血再灌注損傷［4］。本實驗基于古方補陽還五湯，重用黃芪及具有辛味、開通玄府的藥物（如水蛭、全蝎）組成加味益氣通玄方，并基于PI3K／Akt-eNOS 信號通路探討該方對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用，以期為臨床用藥提供依據。

1 材料

1.1 動物 72 只SD 雄性大鼠，體質量200～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（川）2015-030，動物使用許可證號SYXK（川）2014-189。實驗通過四川大學華西醫院倫理委員會批準，批號2019284A，其間盡量減少動物痛苦。

1.2 儀器 RM2016 切片機購自德國徠卡公司；BMJ-III 型包埋機、TSJ-II 全自動封閉式組織脫水機、PHY-III 型病理組織漂烘儀均購自常州中威電子儀器廠；AE31 倒置顯微鏡購自廈門麥克奧迪實業有限公司；JY200C 電泳儀、JY-SCZ4+垂直電泳槽均購自北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 試劑與藥物 加味益氣通玄方的成人單日用量為155 g 生藥，由80 g 黃芪（批號19080063）、12 g 當歸（批號19110059）、12 g 川芎（批號19100192）、12 g 赤芍、10 g 地龍（批號19070217）、10 g 桃仁（批號18110108）、10 g 紅花（批號19090095）、6 g 水蛭（批號18050159）、3 g 全蝎（批號17050133）組成，上述藥材購自四川新綠色藥業科技發展有限公司，西南醫科大學附屬中醫院制劑室制備中藥湯劑濃縮液。氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自美國Sigma-Aldrich 公司（貨號T8877，批號BCBX0337）；原位末端轉移酶標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自瑞士 Roche 公司（貨號 11772465001，批號37412800）；裂解液購自上海雅酶生物科技有限公司（貨號PC101，批號012B1050）；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號23227，批號TG268825）、ECL 顯影試劑盒（貨號32109，批號TF269 477 A）購自美國 Thermo 公司；抗 Akt（ab8805 ）、p-Akt（ab38449 ）、eNOS（ab76198 ）、p-eNOS（ab184154）、Bcl-2（ab32124）、Bax（ab32503）、cleaved-Caspase3（ab32042）、β-actin（ab5694）的一抗，以及辣根過氧化物酶標記的二抗（ab205718）購自英國Abcam 公司。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 72 只大鼠經1 周適應性飼養后，隨機分為假手術組，模型組，阿司匹林組及加味益氣通玄方高、中、低劑量組，每組12 只。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注模型［5］，方法為術前禁食12 h、禁水4 h，4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿頸部正中線縱向切口，分離右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）、頸內動脈（internal carotid artery，ICA），分別結扎CCA 近心端、ECA 和ICA 近分叉出打活結，在CCA 近分叉處剪一倒“V”型切口，插入線栓，于插入線栓處用備用線結扎（以不出血為度），松開ICA 處活結，緩慢推送線栓和栓線，線栓進入ICA 后調整線栓頭端向內向上，有阻力時停止推進，此時線栓頭端正好處于大腦中動脈（MCA）起始部，造成阻斷，缺血2 h后輕柔拔出線栓；假手術組僅進行頸部血管分離，不插入線栓，造模完成2 h 后大鼠出現對側偏癱，可認為造模成功。造模24 h 后，阿司匹林組以60 mg／kg 劑量灌胃給藥，每天1 d，連續14 d；加味益氣通玄方成人單日用量為155 g，而大鼠和人用藥劑量的折算系數為6.25，假設人體質量為70 kg，故大鼠正常劑量為13.84 g／kg，作為中劑量組，高、低劑量組分別為中劑量組的2、0.5 倍，即27.68、6.92 g／kg，分別灌胃給藥，每天1 次，連續14 d；假手術組、模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水，每天1 次，連續14 d。

2.2 神經缺損評分檢測 于給藥后第3、7、14 天，除假手術組外各組隨機選取8 只大鼠，根據Chen 等［6］報道的修正版神經功能缺損評分（modified neurological severity scores，mNSS）進行神經功能評價，主要內容包括運動實驗（提尾實驗0～3 分、行走實驗0～3 分）、感覺實驗（放置實驗1 分、本體感覺實驗1 分、平衡實驗0～6分）、反射喪失和不正常運動（耳廓反射1 分、角膜反射1 分、驚恐反射1 分）及癲癇、肌陣攣、肌張力障礙（各1 分），總分18 分，分數越高，神經功能缺損越嚴重。

2.3 腦梗死體積比例檢測 第7 天，各組隨機取3 只大鼠麻醉取腦，額葉切片2 mm，2%TTC 染色15 min，缺血性梗塞區域被染成白色，非缺血性梗塞區域被染成紅色，拍攝圖像，通過Image J 軟件計算腦梗死面積、腦組織總面積（腦梗死面積＝對側半球面積-梗死側半球正常組織面積），兩者乘以切片厚度即為腦梗死體積、全腦體積，腦梗死體積比例＝（腦梗死體積／全腦體積）×100%。

2.4 腦組織病理學觀察和凋亡測定 將大鼠腦組織制成石蠟組織切片（厚度4 μm），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理變化。再根據TUNEL 試劑盒說明書進行腦組織凋亡檢測，根據陽性細胞數量計算細胞凋亡率。

2.5 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗 收集大鼠梗塞區域的皮質組織，裂解液充分裂解組織，提取總蛋白，BCA 蛋白測定試劑盒測定濃度，進行聚丙烯酰氨凝膠電泳蛋白電泳（SDS-PAGE），轉移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，5% 脫脂牛奶封閉1 h，并與Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3 蛋白的一抗在4 ℃下孵育過夜，將膜與耦聯有辣根過氧化物酶的二抗孵育，ECL 使條帶可視化。以β-actin 為內參，對結果進行均一化處理。

2.6 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析（ANOVA），多重比較采用最小顯著性差異法（LSD）。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠神經功能評分 第3 天，與模型組比較，阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組神經功能評分均降低（P＜0.01），加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組均高于加味益氣通玄方高劑量組（P＜0.01）。第7 天，各給藥組神經功能評分均低于模型組（P＜0.01），加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方中劑量組、高劑量組（P＜0.01）。第14 天，各給藥組神經功能評分均低于模型組（P＜0.01），加味益氣通玄方低劑量組高于加味益氣通玄方高劑量組（P＜0.01）。各組大鼠神經功能評分均隨時間延長均呈下降趨勢。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分（分，， n＝8）Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups（score，， n＝8）

表1 各組大鼠神經功能評分（分，， n＝8）Tab.1 Neurological function scores of rats in various groups（score，， n＝8）

注：與模型組比較，??P＜0. 01；與加味益氣通玄方高劑量組比較，＄＄P＜0. 01；與加味益氣通玄方中劑量組比較，＆＆P＜0.01。

3.2 大鼠腦組織相對梗死體積 正常大鼠腦組織呈紅色，TTC 染色后變為白色。與模型組比較，阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組、加味益氣通玄方中劑量組大鼠相對梗死體積降低（P＜0.05，P＜0.01）；與加味益氣通玄方高劑量組比較，加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組大鼠相對梗死體積升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色及相對梗死體積Fig.1 TTC staining and relative infarct volumes of brain tissue in rats in various groups

3.3 大鼠腦組織病理損傷 假手術組大鼠大腦皮質神經元細胞胞核形態和數量正常，核大而圓，核仁清晰，胞質染色均勻，部分胞質內尼氏小體清晰，未見明顯壞死；模型組大鼠正常細胞數量減少，神經元結構不明顯，神經纖維水腫變性，排列散亂，染色明顯變淺，細胞體積減小，周圍間隙增寬，細胞核固縮或溶解消失；加味益氣通玄方低劑量組、中劑量組大鼠可見部分神經元變性或壞死；加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組大鼠偶見神經元變性或壞死；各給藥組大鼠細胞與模型組比較，均排列規則，結構清晰。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織病理損傷Fig.2 Pathological injury of brain tissue in rats in various groups

3.4 大鼠腦組織細胞凋亡 與假手術組比較，模型組大鼠TUNEL 染色呈陽性的細胞數量上升，腦組織細胞凋亡率增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織細胞凋亡率均降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織細胞凋亡Fig.3 Cell apoptosis of brain tissue in rats in various groups

3.5 大鼠PI3K／Akt-eNOS 通路相關蛋白、凋亡相關蛋白表達 PI3K／Akt-eNOS 通路相關蛋白Akt、eNOS 各組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與假手術組比較，模型組p-Akt／Akt、peNOS／eNOS 比值降低（P＜0.01）；與模型組比較，加味益氣通玄方高劑量組、阿司匹林組p-Akt／Akt、p-eNOS／eNOS 比值升高（P＜0.05，P＜0.01），而加味益氣通玄方中劑量組、低劑量組無明顯變化（P＞0.05）。見圖4。

此外，與假手術組比較，模型組抗凋亡蛋白Bcl-2 表達降低（P＜0.01），促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase3 表達及Bax／Bcl-2 比值升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組、加味益氣通玄方高劑量組Bcl-2 表達升高（P＜0.01），Bax、cleaved-Caspase3 表達量及Bax／Bcl-2 比值降低（P＜0.01）；加味益氣通玄方中劑量組Bcl-2 表達升高（P＜0.01），Bax／Bcl-2 比值下降（P＜0.01），Bax 表達量有下降趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），cleaved-Caspase3 表達降低（P＜0.05）；加味益氣通玄方低劑量組Bax／Bcl-2 比值降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠PI3K／Akt-eNOS 通路相關蛋白、凋亡相關蛋白表達Fig.4 Expressions of PI3K／Akt-eNOS pathwayrelated proteinsandapoptosis-related proteins in rats in various groups

4 討論

本研究基于中醫玄府理論，結合目前中醫對中風病的研究現狀，并依據古今醫家相關論述及現代研究，總結該病以“虛、風、火、痰、瘀、毒”等為基本病機，確定玄府郁閉貫穿中風發病的整個階段，以古方補陽還五湯為基礎，用黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍、水蛭、全蝎九味中藥組成加味益氣通玄方。結果顯示，該方能有效緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能缺損，降低腦梗塞體積，改善皮質區域病理變化，表明它能保護腦組織免受缺血再灌注損傷。

大量研究表明，細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷有關［7-9］。抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax 定位于線粒體，響應凋亡刺激，Bax 從細胞質中的Bcl-2／Bax 異二聚體解離后Bax 易位到線粒體，刺激細胞色素C 釋放，并進一步激活了半胱天冬酶級聯反應，使Caspase3 裂解成活化的cleaved-Caspase3，最終導致細胞凋亡［10-11］，并且Bcl-2 與Bax 之間的動態平衡在腦缺血時的細胞命運中起著關鍵作用［12］。已有研究表明，腦缺血再灌注損傷可通過降低Bcl-2 表達、提高Bax 表達來加速生理性細胞凋亡［13-14］，本實驗也得到相似結果，表明加味益氣通玄方可以通過提高Bcl-2 表達，降低Bax、cleaved-Caspase3 表達及Bax／Bcl-2 比值來保護腦組織。

eNOS 可通過抑制促凋亡蛋白來發揮促增殖作用［15-18］，它產生的NO 對腦缺血再灌注損傷起到保護作用，而作為其活性和缺血性損傷結果的關鍵調節劑，磷酸化eNOS 常用于評估腦血管功能［19］，并且還能調控體內腦血流量，改善慢性腦灌注不足引起的認知障礙［20］。eNOS 活性受多種機制調控，其中經典信號通路PI3K／Akt 是調控其活化的關鍵途徑之一，故阻斷PI3K／Akt 可抑制其活性［21］。前期報道，與假手術大鼠比較，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中PI3K／Akt-eNOS 活性降低［8，22］；本研究也發現，缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中p-Akt、p-eNOS 表達低于假手術組，而加味益氣通玄方干預后被重新激活。

綜上所述，加味益氣通玄方可緩解腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能缺損，降低腦梗塞體積，改善皮質區域病理變化，減失皮質區細胞凋亡，其機制可能是降低了Bax／Bcl-2 比值，激活PI3K／AkteNOS 通路。