潞黨參甾體類成分及其抗炎活性

張俊卿 李建寬王 妍吉姣姣高建平?

（1.山西醫科大學藥學院，山西太原 030001；2.山西醫科大學第一醫院藥學部，山西太原 030001）

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.moesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，具有健脾益肺、養血生津的功效，在我國傳統醫學中作為補益類中藥被廣泛使用［1］。在現代臨床中，黨參常被應用于心血管系統［2］、消化系統［3］及呼吸系統疾病［4］等。炎癥反應是機體的一種以防御為主的基本病理過程，與各系統疾病的發生發展密切相關［5-7］。炎癥作為眾多疾病的共性機制，開展相關研究或將為疾病的預防、診斷及治療提供新策略。針對黨參的抗炎活性研究發現，其石油醚萃取部位抗炎效果顯著［8］；甲醇提取物可顯著抑制炎性介質NO 水平和 iNOS 的表達［9］；輪葉黨參lancemaside A 通過抑制IKK／NF-κB 通路發揮抗炎作用［10］，但黨參活性物質基礎尚不明確。本實驗從潞黨參中分離得到4 個甾體類化合物，通過建立體外LPS 誘導的RAW264.7 細胞炎癥模型對其抗炎活性進行評價，以期為其有效物質的進一步開發提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 潞黨參購于山西省長治市平順縣，經山西醫科大學藥學院高建平教授鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根，樣品保存于山西醫科大學藥學院中藥教研室（編號20170901）。小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7）購于武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號CL-0190）。

DMEM 高糖培養基（美國賽默飛世爾Gibco 公司，批號 8119281）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX 公司，批號FBSSA00818-1）；L8880 型LPS（批號1128W031，北京索萊寶科技有限公司）；青霉素鏈霉素混合液（批號20190320，北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數CCK-8 試劑盒（批號N20821，北京全式金公司）；NO 試劑盒（E-BC-K035-M）、IL-6 試劑盒（E-EL-M0044c）、TNF-α 試劑盒（E-EL-M0049），均購于武漢Elab-Science 公司。柱層析硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；TLC 硅膠60 F254（德國Merck 公司）。甲醇、石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷均為分析純。

1.2 儀器 Avance Ⅲ型400 MHz 窄腔液體核磁共振儀（德國布魯克公司）；GCMS-QP2010 質譜儀（日本島津公司）；KDM 型調溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；A-1000s 型真空水流抽氣機（上海愛朗儀器有限公司）；DLSB-5／20 型低溫冷卻液循環泵（鄭州長城科工貿有限公司）；TH-Ⅱ型數控薄層顯色加熱器（上海科哲生化有限公司）；HX-01PW 型薄層噴霧器（武漢恒信儀器有限公司）；Goodsee-Ⅰ薄層色譜攝影儀（上海科哲生化有限公司）；DZF-6020MBE 型真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）；HF90 型CO2培養箱（Heal Force 力康生物醫療有限公司）；SW-CJ-2F型潔凈工作臺（上海博迅醫療生物儀器公司）；DMi8／DFC45OC 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；AMR-100 型全自動酶標分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）；SC-2546 型低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 提取與分離 取干燥潞黨參25 kg，粉碎，甲醇回流提取3 次（分別回流2、1.5、1 h），合并提取液并減壓濃縮，浸膏用水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，回收溶劑后得石油醚部位0.498 kg、乙酸乙酯部位0.066 kg、正丁醇部位0.356 kg。石油醚部位經硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯（70∶1、60∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶2），二氯甲烷-甲醇（40∶1、25∶1、10∶1、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4）梯度洗脫，用薄層色譜（TLC）檢測合并相似餾分，減壓回收溶劑后得到餾分段Fr.1～Fr.20。Fr.8（5.0 g）經硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯（60∶1～10∶1）梯度洗脫，分離得到5 個餾分Fr.8.1～Fr.8.5。其中，Fr.8.4（1.0 g）經反復硅膠柱色譜分離得到菠甾酮類化合物（1～2，330 mg）；Fr.12（7.0 g）以石油醚-乙酸乙酯（8∶2～6∶4）梯度洗脫，得到6 個餾分Fr.12.1～Fr.12.6，Fr.12.4 進行硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（8∶2）洗脫，得到菠甾醇類化合物（3～4，880 mg）。

2.2 細胞培養 小鼠巨噬細胞株RAW264.7 采用含有10% 胎牛血清、1% 青霉素（1×105U／mL）、鏈霉素（1×105μg／L）的DMEM 高糖培養基培養，條件為37 ℃、5%CO2，待細胞融合達到70%～80%后進行細胞傳代。實驗所用細胞均處于對數生長期，狀態良好。

2.3 甾體化合物溶液制備及分組 菠甾酮化合物（1～2）和菠甾醇化合物（3～4）均用二甲基亞砜（DMSO）完全溶解制備成質量濃度為0.5 mg／mL母液，再用完全培養基分別稀釋為3 個質量濃度組（1、2、4 μg／mL），使DMSO 最大工作液質量濃度在5 μg／mL 以下。

2.4 細胞炎癥模型建立 將對數生長期的RAW264.7 細胞以1×105／mL 的濃度接種于96 孔板，于37 ℃，5%CO2條件下培養24 h，棄去孔內培養基，分別加入含有不同質量濃度LPS 的培養基，并設置空白組和對照組，每組6 個復孔。繼續培養24 h 后，采用CCK-8 法測定不同質量濃度LPS 對細胞活力的影響，Griess 法檢測其誘導細胞產生炎癥介質NO 水平，從而確定后續細胞炎癥模型中質量濃度。

2.5 甾體化合物對細胞活力的影響 將處于對數生長期的RAW264.7 細胞用刮刀刮下，加完全培養基制備單細胞懸液，濃度調整至約5×104／mL，按每孔100 μL 將細胞接種于96 孔細胞板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。棄去舊培養基，加入用培養基稀釋的各濃度甾體化合物，每孔100 μL，空白組和對照組也分別加入等量的培養基，每組設6 個復孔，繼續置于培養箱中培養24 h。利用CCK-8 法測定細胞活力，在每孔中加入10 μL CCK 試劑，在培養箱中繼續培養2 h，用酶標儀測定450 nm 下每孔的吸光度值并計算細胞存活率。

2.6 甾體化合物對LPS 誘導的RAW264.7 釋放NO水平的影響 分別取處于對數生長期且狀態良好的RAW264.7 細胞，調整細胞濃度為1×105／mL，接種于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h 后，棄去舊培養液，設置對照組、LPS 模型組、甾體化合物+LPS 組（加入含各質量濃度化合物的培養基120 μL 預保護4 h，吸出含藥培養液，換為含LPS 的培養基120 μL）。每孔終體積均為120 μL，每組設3 個復孔，各處理組均在相同時間點加入LPS，繼續培養24 h 后，每孔取其細胞上清液100 μL，依照NO 試劑盒說明書的方法，在酶標儀550 nm 處測定OD值，并計算NO 水平。抑制率＝（1 -NO 濃度藥物組／NO 濃度模型組）×100%。

2.7 甾體化合物對LPS 誘導的RAW264.7 分泌炎性因子的影響 取處于對數生長期且狀態良好的RAW264.7 細胞，調整細胞濃度為1×105／mL，接種于24 孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。24 h 后，棄去舊培養液，設置空白對照組、LPS 模型組、甾體化合物+LPS 組（加入含各質量濃度化合物的培養基500 μL 預保護4 h，吸出含藥培養液，換為含LPS 的培養基500 μL）。每組設3 個復孔，各處理組均在相同時間點加入LPS，繼續培養24 h 后，收集各組每孔細胞上清液，稀釋適當倍數后，取100 μL，用IL-6 和TNF-α Elisa 試劑盒按照說明書的方法檢測炎性因子的含有量。

3 結果

3.1 結構鑒定

化合物1：白色結晶，EI-MSm／z：410，分子式C29H46O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.17（m，1H，H-7），5.12（dd，J＝15.0，8.6 Hz，1H，H-22），5.02（dd，J＝15.2，8.6 Hz，1H，H-23），2.41（td，J＝14.5，5.9 Hz，4H，CH2-2，CH2-4），1.00（s，3H，CH3-19），0.92（d，J＝6.4 Hz，3H，CH3-21），0.84（d，J＝5.2 Hz，3H，CH3-26），0.79（t，J＝6.1 Hz，3H，CH3-29），0.78（d，J＝5.1 Hz，3H，CH3-27），0.55（s，3H，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：211.8（C-3），139.5（C-8），138.0（C-22），129.5（C-23），117.0（C-7），55.8（C-17），55.0（C-14），51.2（C-24），48.8（C-9），44.2（C-4），43.3（C-13），42.8（C-5），40.8（C-20），39.3（C-12），38.7（C-1），38.1（C-2），34.4（C-10），31.8（C-25），30.0（C-6），28.5（C-16），25.4（C-28），23.0（C-15），21.7（C-11），21.3（C-27），21.1（C-21），19.0（C-26），12.4（C-19），12.2（C-29），12.1（C-18）。以上數據與文獻［11-12］一致，故鑒定為α-菠甾酮。

化合物2：白色結晶，EI-MSm／z：412，分子式C29H48O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.17（m，1H，H-7），2.41（td，J＝14.5，5.9 Hz，4H，CH2-2，CH2-4），1.00（s，3H，CH3-19），0.56（s，3H，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：211.8（C-3），139.4（C-8），116.9（C-7），56.0（C-14），54.9（C-17），48.8（C-9），45.8（C-24），44.2（C-4），43.2（C-13），42.8（C-5），39.4（C-12），38.7（C-1），38.1（C-2），36.5（C-20），34.4（C-10），33.8（C-22），30.0（C-6），29.1（C-25），27.9（C-16），26.1（C-23），23.0（C-28），22.9（C-15），21.7（C-11），19.8（C-26），19.0（C-27），18.9（C-21），12.4（C-19），11.9（C-29），11.8（C-18）。以上數據與文獻［13］一致，故鑒定為22，23-二氫菠菜甾酮。

化合物3：無色針狀結晶，EI-MSm／z：412，分子式C29H48O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.14（m，1H，H-7），5.14（dd，J＝15.0，8.0 Hz，1H，H-22），5.01（dd，J＝15.8，8.0 Hz，1H，H-23），3.57（m，1H，H-3），1.01（d，J＝6.6 Hz，3H，CH3-21），0.91（d，J＝6.3 Hz，3H，C-26），0.84（t，J＝6 Hz，3H，CH3-29），0.83（s，3H，CH3-19），0.78（d，J＝5 Hz，3H，C-27），0.53（s，3H，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：139.6（C-8），138.2（C-22），129.4（C-23），117.4（C-7），71.0（C-3），55.9（C-17），55.1（C-14），51.2（C-24），49.4（C-9），43.3（C-13），40.8（C-20），40.2（C-5），39.4（C-12），37.9（C-4），37.1（C-1），34.2（C-10），31.8（C-25），31.4（C-2），29.6（C-6），28.5（C-16），25.4（C-28），23.0（C-15），21.5（C-11），21.4（C-21），21.1（C-26），19.0（C-27），13.0（C-19），12.2（C-29），12.0（C-18）。以上數據與文獻［14］一致，故鑒定為α-菠甾醇。

化合物4：無色針狀結晶，EI-MSm／z：414，分子式C29H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.14（m，1H，H-7），3.57（m，1H，H-3），1.01（d，J＝6.6 Hz，3H，CH3-21），0.91（d，J＝6.3 Hz，3H，C-26），0.84（t，J＝6 Hz，3H，CH3-29），0.83（s，3H，CH3-19），0.78（d，J＝5 Hz，3H，C-27），0.53（s，3H，CH3-18）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：139.5（C-8），117.4（C-7），71.0（C-3），56.1（C-17），55.0（C-14），49.4（C-9），45.8（C-24），43.2（C-13），40.2（C-5），39.5（C-12），37.9（C-4），37.1（C-1），36.6（C-20），34.2（C-10），33.9（C-22），31.4（C-2），29.1（C-6），29.1（C-25），27.9（C-16），26.1（C-23），23.0（C-28），22.9（C-15），21.5（C-11），19.8（C-26），19.0（C-27），18.9（C-21），13.0（C-19），11.9（C-29），11.8（C-18）。以上數據與文獻［15］一致，故鑒定為22，23-二氫菠菜甾醇。

3.2 RAW264.7 細胞炎癥模型建立 不同質量濃度的LPS 可不同程度地引起細胞增殖，并濃度依賴性地誘導炎癥介質NO 產生，結果見圖1。10 ng／mL LPS 組與對照組比較，其細胞增殖程度差異無統計學意義（P＞0.05），但NO 水平增加（P＜0.01），故選擇其作為后續細胞實驗的炎癥模型。

圖1 不同質量濃度LPS 對細胞活力、NO 水平的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LPS on cell viability and level of NO

3.3 甾體化合物對RAW 264.7 細胞活力的影響采用CCK-8 法檢測細胞經甾體化合物處理后的細胞活力。結果顯示，菠甾酮化合物（1～2）在質量濃度為5 μg／mL 時細胞活力稍有下降，但并無統計學差異（P＞0.05）；菠甾醇化合物（3～4）在質量濃度5 μg／mL 以下時均未對細胞活力造成影響。因此，后續細胞實驗中甾體化合物質量濃度均在5 μg／mL以下，見圖2。

圖2 菠甾酮、菠甾醇對RAW264.7 細胞活力的影響Fig.2 Effects of spinasteron and spinasterol on the viability of RAW264.7 cells

3.4 甾體化合物對LPS 誘導RAW 264.7 細胞釋放NO 水平的影響 與對照組比較，10 ng／mL LPS 可誘導RAW264.7 細胞上清中NO 水平增加（P＜0.01）；藥物預處理組與模型組比較，藥物組均能顯著抑制細胞上清中的NO 水平。菠甾酮在1、2、4 μg／mL 質量濃度下對LPS 刺激條件下產生的NO抑制率分別為22.69%、37.23%、46.87%，菠甾醇在1、2、4 μg／mL 質量濃度下對LPS 刺激條件下產生的NO 抑制率分別為11.17%、18.00%、20.31%，見圖3A。菠甾酮能顯著降低細胞炎癥模型中NO 水平，并呈劑量依賴性，而菠甾醇對NO水平的抑制活性不呈劑量依賴性。

3.5 甾體化合物對LPS 誘導RAW 264.7 細胞分泌IL-6 及TNF-α 的影響 與對照組比較，LPS 組IL-6、TNF-α 水平均顯著增加。甾體化合物預處理4 h后，與LPS 組比較，菠甾酮在1、2、4 μg／mL質量濃度下IL-6 水平抑制率分別為43.59%、62.23%、88.37%，TNF-α 抑制率分別為34.79%、50.61%、82.48%；菠甾醇在1、2、4 μg／mL質量濃度下對IL-6 水平的抑制率分別為36.82%、49.28%、83.10%，對TNF-α 水平的抑制率為19.43%、44.64%、72.79%，見圖3B～3C。由此可見，菠甾酮和菠甾醇均可顯著抑制LPS 誘導RAW264.7 細胞炎性因子IL-6、TNF-α 的分泌，并呈濃度依賴關系，而且相同質量濃度下前者活性更強。

圖3 甾體化合物對NO、IL-6、TNF-α 水平的影響Fig.3 Effect of steroids on levels of NO，IL-6 and TNF-α

4 討論

甾體類是自然界中廣泛存在的一種成分，均具有環戊烷駢多氫菲的甾體母核。甾體類化合物分類較多，其中植物來源的甾醇因其具有廣泛的藥理活性被高度關注，近年大量研究表明植物甾醇具有降血脂［16］、保護胃黏膜［17］、抗腫瘤［18］、抗炎［19］等作用。對于植物甾醇的抗炎活性，報道較多的是β-谷甾醇［20］、巖藻甾醇［21］、α-菠甾醇［22-23］以及麥角甾醇［24］，而對于其他結構類型的植物甾醇研究相對較少。本研究分離得到4 個甾體類化合物中僅α-菠甾醇有相關抗炎活性的文獻報道［22-23］。4 個化合物在化學結構上具有一定的相似性，α-菠甾醇與α-菠甾酮僅在C-3 位上的取代不同（分別為—OH取代和＝O 取代），另外2 個甾體化合物則分別為α-菠甾醇及α-菠甾酮的C-17 側鏈中的不飽和雙鍵被氫化。本研究通過建立體外細胞炎癥模型，比較了菠甾酮和菠甾醇的抗炎活性，發現菠甾酮的各項體外抗炎活性指標（NO、IL-6、TNF-α）均優于菠甾醇，提示C-3 位上的不同取代基可能會對甾體化合物的抗炎活性產生一定影響。與菠甾酮比較，菠甾醇對NO 水平的抑制活性不成濃度依賴性關系，推測炎性介質NO 的產生可能受甾體結構中C-3 位取代基的影響更大。據文獻報道［25］，LPS 通過激活MAPK 和NF-κB 信號途徑刺激誘導型NO 合成酶（iNOS）的合成而催化產生過量NO 參與機體炎癥反應，這提示具有不同取代基的甾體化合物可能是對分泌NO 過程中的某些途徑產生不同的影響，從而造成NO 水平的差異。這種甾體結構上的差異與發揮抗炎活性的相關性研究尚需在今后進一步探討。