蓽茇根化學(xué)成分及其抗腫瘤活性

惠昱昱陳 鏑 楊秀芳?

（1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710021）

蓽茇Piper longumL.為胡椒科胡椒屬藥用植物，主要產(chǎn)于菲律賓、印尼，在我國(guó)云南有野生［1-2］，具有溫中散寒、下氣止痛的功效，臨床用于治療胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、腎寒、嘔吐等癥，蒙醫(yī)、中醫(yī)都用其果實(shí)入藥，其溫?zé)嶂钥芍委熤薪刮负劝Y［3-5］。維醫(yī)不同于蒙、藏、中醫(yī)，不是用蓽茇果實(shí)，而是用其根莖，作為消化系統(tǒng)的常用藥材［6］。

國(guó)內(nèi)對(duì)蓽茇的研究主要集中在果實(shí)化學(xué)成分、胡椒堿提取工藝及含量測(cè)定等方面，而對(duì)蓽茇根化學(xué)成分的報(bào)道較少［6-8］。因此，本研究對(duì)蓽茇根進(jìn)行化學(xué)成分分離及鑒定，從中得到10 個(gè)化合物，其中3～4、7～10 為首次從該植物中分離得到，5表現(xiàn)出較突出的抗腫瘤活性。

1 材料

B260 旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；XT5 顯微熔點(diǎn)測(cè)試儀（溫度計(jì)未校正，北京市科儀電光儀器廠）；核磁共振光譜用AvanceⅢ-400 MHz 核磁共振儀測(cè)定（TMS 內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司）；ESI-MS 譜用ImpactHD Q-TOF 型質(zhì)譜儀測(cè)定（瑞士Bruker 公司）；柱層析硅膠（200～300目）、薄層層析硅膠G（青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（上海浩然生物技術(shù)有限公司）。石油醚、乙酸乙酯、甲醇等試劑均為分析純。蓽茇根采自云南山區(qū)，經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院康永祥教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物蓽茇Piper longumL.的根，陰干后粉碎備用。

2 提取與分離

蓽茇根在室溫下陰干稱定質(zhì)量，約4.5 kg，粉碎，加入95% 乙醇，靜置24 h 回流提取，重復(fù)3 次，提取液過(guò)濾合并，減壓濃縮得到浸提物約470 g。蓽茇根的浸提物用硅膠拌樣，通過(guò)硅膠柱色譜用石油醚、乙酸乙酯、甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，最終得石油醚部位24 g、乙酸乙酯部位203 g、甲醇部位232 g。乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到9 個(gè)組分Fr.A1～A9，反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱分離，經(jīng)薄層色譜檢識(shí)、多次重結(jié)晶后，從Fr.A2 得到化合物1（465.8 mg）、9（48.8 mg），從Fr.A3 得到化合物5（12 mg）、6（8.59 g）、8（20 mg）、10（30 mg），從Fr.A4 得到化合物7（70.4 mg），從Fr.A5 得到化合物2（3.22 g）。石油醚部位經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯及乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，得到9 個(gè)組分Fr.B1～B9，從Fr.B2 得到化合物3（2.16 g），從Fr.B6得到化合物4（30 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色針狀結(jié)晶（石油醚），mp135～137 ℃。ESI-MSm／z：413［M-H］-，分子式C29H50O。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.36（1H，m，H-6），3.53（1H，m，H-3），0.69（3H，d，H-18），1.03（3H，s，H-19），0.93（3H，d，J＝6.5 Hz，H-21），0.86～0.78（9H，m，H-26，H-27，H-29）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：36.5（C-1），31.6（C-2），71.8（C-3），42.2（C-4），140.7（C-5），121.7（C-6），31.8（C-7），31.4（C-8），49.6（C-9），36.1（C-10），21.0（C-11），39.7（C-12），40.5（C-13），56.0（C-14），23.8（C-15），28.2（C-16），56.0（C-17），11.8（C-18），18.7（C-19），35.6（C-20），18.7（C-21），33.9（C-22），25.9（C-23），45.7（C-24），28.2（C-25），19.3（C-26），18.7（C-27），22.5（C-28），11.3（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm／z：575 ［MH］-，分子式C35H60O6，mp 296～298 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.34（1H，m，H-6），4.90（1H，H-1′），4.44（2H，t，J＝11.48 Hz，H-6′），4.22（1H，d，J＝7.72 Hz，H-4′），3.64（1H，m，H-3），0.99（3H，H-21），0.96（3H，H-19），0.91（3H，d，J＝6.32 Hz，H-26），0.84（3H，H-29），0.80（3H，H-27），0.66（3H，s，H-18）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：140.3（C-5），121.1（C-6），100.7（C-1′），76.8（C-3），76.8（C-3′），76.7（C-5′），73.4（C-2′），70.0（C-4′），61.0（C-6′），56.1（C-14），55.3（C-17），49.5（C-9），45.0（C-24），41.8（C-13），40.2（C-12），38.2（C-4），36.7（C-20），36.1（C-1），35.4（C-10），33.3（C-22），31.3（C-7），31.3（C-8），29.2（C-2），28.6（C-25），27.7（C-16），25.3（C-23），23.8（C-15），22.5（C-28），20.5（C-11），19.7（C-26），19.0（C-19），18.8（C-21），18.5（C-27），11.7（C-18），11.6（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］一致，故鑒定為胡蘿卜苷。

化合物3：白色粉末（石油醚），ESI-MSm／z：367 ［M-H］-，mp 52～54 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.89（3H，t，-CH3），1.27（40H，m），1.64（2H，m，-CH2），2.36（2H，t）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：179.7（C-1），33.5（C-2），26.3（C-3），23.1（C-23），13.6（C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］一致，故鑒定為二十四烷酸。

化合物4：白色粉末（石油醚），ESI-MSm／z：297 ［M-H］-。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.88（3H，t，-CH3），1.27（30H，m，H-4～13），1.64（2H，m，-CH2），2.37（2H，t）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：180.4（C-1），34.5（C-2），27.7（C-3），22.2（C-18），13.1（C-19）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］一致，故鑒定為十九烷酸。

化合物5：白色晶體（甲醇），ESI-MSm／z：316 ［M-H］-。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.04（1H，m，H-3），6.95（1H，m，H-4），2.48（2H，m，H-5′），4.03（2H，m，H-6），6.80（1H，s，H-2′，6′），7.66（1H，d，H-7′），7.69（1H，d，H-8′），3.90（3H，s，OCH3-3′，OCH3-5′），3.85（3H，OCH3-4′）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：166.3（C-2），126.3（C-3），145.9（C-4），25.2（C-5），42.1（C-6），131.1（C-1′），106.0（C-2′，C-6′），153.8（C-3′，C-5′），140.3（C-4′），144.3（C-7′），121.5（C-8′），169.3（C-9′），56.6（OCH3-3′，OCH3-5′），61.4（OCH3-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］一致，故鑒定為蓽茇酰胺。

化合物6：無(wú)色方晶（甲醇），mp135～136 ℃。碘化鉍鉀反應(yīng)陽(yáng)性。ESI-MSm／z：284 ［MH］-。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.44（1H，d，J＝14.6 Hz，H-2），7.40（1H，m，H-3），6.77（1H，m，H-4），6.74（1H，m，H-5），6.97（1H，d，J＝1.4 Hz，H-2′），6.77（1H，d，J＝80 Hz，H-5′），6.88（1H，dd，J＝8.0，1.4 Hz，H-6′），5.96（2H，s，-O-CN2-O-），3.55（2H，brs，H-1″），1.61（2H，m，H-2″），1.61（2H，m，H-3″），1.60（2H，m，H-4″），3.46（2H，brs，H-5″）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：165.3（C-1），120.0（C-2），142.4（C-3），125.3（C-4），138.1（C-5），130.9（C-1′），105.6（C-2′），148.1（C-3′），148.0（C-4′），108.4（C-5′），122.5（C-6′），101.3（-0-CH2-O），43.2（C-1″），26.7（C-2″），24.6（C-3″），25.6（C-4″），46.9（C-5″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］一致，故鑒定為胡椒堿。

化合物7：黃色粉末，ESI-MSm／z：264 ［MH］-。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.65（1H，brs，-NH），9.27（1H，m，H-5），7.94（1H，m，H-8），7.77（1H，s，H-2），7.53（2H，m，H-6，7），7.13（1H，s，H-9），4.05（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：57.7（3-OCH3），104.8（C-9），109.0（C-2），114.9（C-4a），116.2（C-1），124.8（C-11），125.4（C-7），127.3（C-6），127.2（C-8a），127.9（C-5），129.2（C-8），134.6（C-5a），135.6（C-10），148.8（C-4），150.1（C-3），169.4（C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［14］一致，故鑒定為胡椒內(nèi)酰胺A。

化合物8：黃色粉末，ESI-MSm／z：294 ［MH］-。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.93（3H，s，C3-OCH3），4.45（3H，s，C4-OCH3），7.26（1H，s，H-9），7.49（2H，m，H-6，H-7），7.88（1H，m，H-8），9.28（1H，m，H-5），9.82（1H，brs，NH）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：61.8（C3-OCH3），62.9（C4-OCH3），105.8（C-9），106.3（C-1），112.2（C-10a），125.6（C-7），126.7（C-6），127.2（C-4a），127.6（C-5a），127.8（C-5），129.2（C-8），134.2（C-9a），135.5（C-10），140.0（C-3），153.7（C-4），154.6（C-2），167.5（-C ＝O）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］一致，故鑒定為胡椒內(nèi)酰胺D。

化合物9：油狀物。ESI-MSm／z：332 ［MH］-，分子式 C22H39NO。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.53（1H，br，-NH），5.69（1H，d，J＝14.8 Hz，H-2），7.18（1H，dd，J＝10 Hz，H-3），6.11（1H，m，H-4），6.07（1H，m，H-5），2.17（2H，m，H-6），1.25～1.41（14H，m，H-7，8，9，10，15，16，17），2.01（2H，m，H-11），5.35（1H，m，H-12），5.34（1H，m，H-13），2.01（2H，m，H-14），0.89（3H，m，H-18），3.16（2H，t，J＝6.4 Hz，H-2′），1.68（1H，m，H-3′），0.92（6H，m，H-4，5′）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：166.4（C-1），121.7（C-2），143.2（C-3），128.3（C-4），141.3（C-5），33.0（C-6），28.9（C-7），29.4（C-8），29.6（C-9），29.3（C-10），26.1（C-11），129.5（C-12），129.6（C-13），27.3（C-14），29.4（C-15），32.0（C-16），22.7（C-17），14.1（C-18），46.9（C-2′），28.6（C-3′），20.5（C-4′，5′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］一致，故鑒定為N-異丁基-（2E，4E，12Z）-十八烷基-1-酰胺。

化合物10：黃色粉末，ESI-MSm／z：191 ［MH］-，分子式 C10H8O4。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.59（1H，d，J＝15.9 Hz，3-H），6.96～6.76（3H，d，Ar-H），6.34（1H，d，J＝15.9 Hz，2-H），5.90（2H，s，-O-CH2-O-）；13CNMR（100 MHz，CDCl3）δ：179.7（C-1），33.5（C-2），31.4（C-3），29.2（C-4），29.2（C-5），29.1（C-6），29.1（C-7），28.9（C-8），28.8（C-9），28.5（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17-18］一致，故鑒定為3，4-亞甲二氧基肉桂酸。

4 抗腫瘤活性

選取3 種常見(jiàn)的腫瘤細(xì)胞株，對(duì)化合物5、6進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人前列腺腫瘤細(xì)胞株P(guān)C3、人肺癌腫瘤細(xì)胞株A549、人乳腺癌腫瘤細(xì)胞株MCF7，加入適量0.25%的胰蛋白酶消化后，用DMEM 培養(yǎng)液配成1×105／mL 細(xì)胞懸液，在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，吸去上清液，加入不同質(zhì)量濃度的化合物，分別為200、67、22、7.4、2.5、0 μmol／L，作為實(shí)驗(yàn)組；加入100 μL 5% DMEM 培養(yǎng)液，作為空白組，每組3孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg／mL，用PBS 緩沖液配置），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入100 μL／孔DMSO，振蕩混勻后，在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率，公式為抑制率＝［（1-平均OD值實(shí)驗(yàn)組／平均OD值對(duì)照組）］×100%。

以阿霉素（DOX）作為陽(yáng)性對(duì)照，化合物5～6 對(duì)3 株腫瘤細(xì)胞（PC3、A549、MCF7）的細(xì)胞毒性見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，化合物5 對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，而化合物6 作用較弱。

圖1 化合物5～6 對(duì)3 種細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.1 Cytotoxic activities of compounds 5-6 on three cells

5 討論與結(jié)論

胡椒屬為胡椒科中最大的屬。國(guó)內(nèi)外對(duì)該屬植物的化學(xué)成分和藥理作用作了大量的研究，發(fā)現(xiàn)其中含有生物堿、黃酮、木脂素、揮發(fā)油及脂肪酸類等多種成分。本研究從蓽茇根中分離鑒定了10 個(gè)化合物，化合物3～4、7～10 為首次從蓽茇根中分離得到，其中甾體類1 個(gè)、糖苷類1 個(gè)、有機(jī)酸類3 個(gè)、生物堿類5 個(gè)。近年來(lái)研究表明酰胺類生物堿是胡椒屬植物的主要生物堿成分［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)胡椒堿為蓽茇根中的主要成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為桂皮酰胺類。研究證明此類化合物具有消炎止痛、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、抗抑郁等作用［21］。通過(guò)抗腫瘤活性測(cè)試，表明蓽茇酰胺有顯著的抗腫瘤活性，可彌補(bǔ)蓽茇根化學(xué)成分研究的不足，有利于將其開(kāi)發(fā)成抗癌的天然藥物或保健產(chǎn)品。