甘草黃酮提取分離方法的研究進展

申美倫，梁業(yè)飛，劉廣欣，桑 杰，李翠芹

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，陜西西安 710062）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、光果甘草G.GlabraL.或脹果甘草G.inflataBat.的干燥根及根莖，具有補脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，甘草黃酮具有抗炎、抗氧化［2］、抗病毒［3］等作用，目前已分離出300 多種［4］，主要活性成分有甘草苷、甘草素、異甘草素、光甘草定、甘草查爾酮A 等，其中光甘草定、甘草查爾酮A 分別為光果甘草脹果甘草中特有成分，廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域［5-6］，故生產(chǎn)高品質(zhì)的該類化合物已成為生產(chǎn)企業(yè)急需解決的問題之一。

本文概述了甘草黃酮提取分離的方法，并針對上述操作過程中存在的資源浪費、耗能高、效率低、以單一類成分提取分離為目標(biāo)等問題提出解決方法，以期為該類成分的相關(guān)后續(xù)研究提供參考。

1 甘草總黃酮

1.1 提取方法

1.1.1 溶劑提取法 溶劑提取法利用“相似相溶”原理對目標(biāo)化合物進行提取，雖然存在提取時間長（90～210 min）、提取溫度高（40～90 ℃）、溶劑用量大等缺點，但因其設(shè)備簡單、操作簡便，目前仍作為工業(yè)化生產(chǎn)甘草黃酮類化合物的主要方法。表1 顯示，提取過甘草酸的甘草渣中總黃酮得率較高［7-8］，故可將其作為提取總黃酮的原料，避免資源浪費。另外，不同品種甘草中總黃酮含量有所不同［9］，故研究時應(yīng)其甘草品種。

表1 溶劑提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)（）

表1 溶劑提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)（）

注：a 為提取率，b 為含量，c 為得率。

1.1.2 超聲輔助提取法 超聲輔助提取法根據(jù)空化作用在溶劑中局部形成高溫高壓，使樣品內(nèi)部疏松，增強溶劑穿透能力，提高有效成分提取率［12］，大多用乙醇作為提取溶劑。表2 顯示，與傳統(tǒng)溶劑提取法（40～90 ℃，90～210 min）相比，超聲輔助提取法的溫度較低（45～65 ℃），時間較短（25～120 min）。

1.1.3 微波輔助提取 微波輔助提取法通過微波使藥材細(xì)胞承受高溫高壓瞬間破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分溶于溶劑，從而提高目標(biāo)成分提取率。表3 顯示，與溶劑提取法（90～210 min）、超聲提取法（25～120 min）相比，微波提取法（2.4～6 min）能大大縮短提取時間；β-環(huán)糊精作為提取溶劑時，可提高目標(biāo)成分的水溶性與穩(wěn)定性［16-17］，有利于提取甘草總黃酮。另外，微波提取法與其他方法聯(lián)用也可用于甘草總黃酮的提取［18］。

表2 超聲輔助提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)

表3 微波輔助提取法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)

1.1.4 其他方法 除上述提取方法外，還有雙水相提取法、閃式提取法、超臨界CO2萃取法、微生物混合發(fā)酵提取法等。其中，雙水相提取法將不相混溶的兩相親水性提取體系作為溶劑，具有環(huán)保、低成本、集提取與分離為一體等優(yōu)點［22］，與超聲提取法結(jié)合后可提高兩相提取體系的擴散速度和目標(biāo)成分得率［23］；閃式提取法利用高速機械剪切力迅速將藥材組織破碎，使溶劑更易進入藥材內(nèi)部提取目標(biāo)成分，具有提取時間短、便于熱敏性成分提取等優(yōu)點，與常規(guī)溶劑提取法（60～210 min）相比其提取時間大大縮短（3 min），而目標(biāo)成分得率無明顯變化；超臨界CO2萃取法選擇超臨界CO2作為提取溶劑，可使目標(biāo)成分保持原有生物活性不變，無溶劑殘留，而且提取過程綠色環(huán)保；微生物混合發(fā)酵提取法利用微生物完善植物細(xì)胞內(nèi)木質(zhì)纖維素降解酶系，促使纖維素酶酶解藥材細(xì)胞壁［24］，提高目標(biāo)成分提取率，而且其原料普遍為提取過甘草酸的甘草渣，可避免了資源浪費。具體見表4。

表4 其他方法提取甘草總黃酮的工藝參數(shù)

1.2 分離方法

1.2.1 聚酰胺柱色譜法 聚酰胺色譜利用分子中的酰胺羰基或酰胺鍵上的游離胺基與目標(biāo)成分形成氫鍵而產(chǎn)生吸附，從而達到分離純化目的。姜紅紅等［29］優(yōu)化所得甘草總黃酮最佳純化工藝條件為上樣液pH 5，體積流量1 mL／min，徑高比1∶10，上樣質(zhì)量濃度0.15 g／mL，純度為90.12%。

1.2.2 大孔吸附樹脂法 大孔吸附樹脂利用范德華引力，根據(jù)吸附力和分子篩原理來達到分離、純化、除雜等目的。表5 顯示，用于分離純化甘草總黃酮的大孔吸附樹脂大多為非極性或中極性，其次上樣液、洗脫液pH 由于會影響溶質(zhì)電離程度而影響黃酮吸附率、解吸率［30-31］，故應(yīng)對pH進行考察。

表5 大孔吸附樹脂法分離甘草總黃酮的工藝參數(shù)

1.2.3 連續(xù)離子交換色譜法 連續(xù)離子交換色譜在離子交換色譜的基礎(chǔ)上加以改進，將一個具有多個色譜柱的圓盤與多孔分配閥組合，利用分配閥的相對轉(zhuǎn)換，使吸附、水洗、解析、再生等步驟在一個工藝流程系統(tǒng)中完成，具有溶劑用量小、分離時間短、回收率較高等優(yōu)點。李清潭等［36］利用連續(xù)離子交換色譜法得到最佳分離工藝為上樣液質(zhì)量濃度1.0 mg／mL，體積2.70 L，體積流量12.5 mL／min，乙醇洗脫體積分?jǐn)?shù)70%，體積1.80 L，體積流量12.50 mL／min；NaOH 洗脫濃度 0.50 mol／L，體積0.6 L，體積流量5.0 mL／min，甘草黃酮純度為67.33%，得率2.68%。

1.2.4 反向二維色譜法 反向二維色譜法將不同分離機理的分離模式進行組合，以實現(xiàn)對復(fù)雜化學(xué)成分的分離和制備，具有高峰容量、高通量、高效率等優(yōu)點。朱靖博等［37］利用反向二維色譜法構(gòu)建甘草黃酮的系統(tǒng)分離手段，即以C18為分離及富集填料，甲醇-水、乙腈-水為流動相，水為富集稀釋液，梯度洗脫、稀釋富集液體積流量21 mL／min，上樣量300 mg，富集次數(shù)3 次，可得到16 個甘草黃酮部位和甘草苷、甘草素等9 個化合物。

2 甘草苷、甘草素

甘草苷是甘草重要活性成分，屬于二氫黃酮苷類化合物，具有抗抑郁［38］、心肌細(xì)胞保護作用［39］等藥理活性，2015 年版《中國藥典》 規(guī)定甘草及其浸膏中甘草苷含量應(yīng)不低于0.5%［1］。甘草素屬于二氫黃酮類化合物，是甘草苷苷元部分，具有抗炎［40-41］、保肝解毒［42-43］等作用。

2.1 提取方法

2.1.1 溶劑提取法 朱應(yīng)懷等［44］利用氨水提取甘草苷，得到最佳提取條件為24 倍0.75% 氨水提取3 次，每次60 min，甘草苷平均提取率為72.3%；王振輝等［45］用正交試驗優(yōu)化加熱回流提取甘草苷的最佳回流提取條件為10 倍量70%乙醇提取2 次，每次3 h，甘草苷得率為1.62%。

2.1.2 超聲輔助提取法 叢景香［46］等得到超聲輔助提取甘草苷的最佳條件為酸濃度0.5 mol／L，提取時間1.5 h，提取溫度70 ℃，料液比1∶20，甘草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.850%。另外，與溶劑提取法（3～6 h）相比，超聲輔助提取法（0.4～1.5 h）能縮短提取時間，減少溶劑用量。

2.1.3 酶水解法 任玲等［47］利用酶水解法得到甘草素最優(yōu)提取工藝為纖維素酶添加量1.85%，酶解溫度65 ℃，酶解時間131 min，甘草素轉(zhuǎn)化率為98.6%。

2.2 分離方法 田彥芳等［48］用ADS-7 型大孔吸附樹脂同時分離純化包括甘草苷在內(nèi)的6 種黃酮，避免了僅以甘草苷作為指標(biāo)時造成的資源浪費。除常用的分離方法外［48-49］，還有多種新手段［50-55］的應(yīng)用，其中超濾法［52］、固相萃取法［53-54］等在提取純化甘草苷時能解決設(shè)備難以用于工業(yè)化、工藝繁瑣等問題，適合大生產(chǎn)；絡(luò)合萃取法通過被萃取物和萃取溶劑之間的化學(xué)反應(yīng)，生成可溶于萃取溶劑的新萃合物，從而實現(xiàn)分離目的［55］，以其分離純化甘草苷時不僅能減少溶劑用量，提高回收率，還具有簡化分離工藝、無設(shè)備要求等優(yōu)點，便于工業(yè)化推廣。具體見表6。

表6 分離甘草苷、甘草素的工藝參數(shù)

3 光甘草定

光甘草定屬于異黃酮類成分，是光果甘草中特有的黃酮類化合物，具有較強的酪氨酸酶抑制活性［56］。

3.1 提取方法

3.1.1 溶劑提取法 范玉涵等［57］報道，光甘草定最佳提取工藝為乙醇回流提取2 次，每次2 h，料液比1∶10，得率為0.156 6%。

3.1.2 超臨界CO2萃取法 王宏鵬等［58］利用超臨界CO2萃取光甘草定，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件為萃取溫度45 ℃，萃取壓力25 MPa，靜態(tài)萃取時間60 min，得率為1.259%。

3.1.3 微波輔助提取法 李雪琴等［59］采用微波提取法提取光甘草定，發(fā)現(xiàn)最佳工藝為提取溶劑70%乙醇，料液比1∶15，提取溫度65 ℃，提取時間40 min，粗提得率為1.259%，得率為0.009%。

3.2 分離方法 除常用分離方法外［57，60］，為解決工藝的工業(yè)化適用性問題，固相萃取法［61］、疏水性離子液體萃取法［62］、分子印跡法［63］等新技術(shù)因其顯著減少溶劑用量、可重復(fù)使用、簡化分離工藝、提高光甘草定回收率的優(yōu)點而逐漸被開發(fā)應(yīng)用。具體見表7。

表7 分離光甘草定的工藝參數(shù)

4 甘草查爾酮A

甘草查爾酮A 為查爾酮類成分，是脹果甘草中特有的黃酮類化合物，具有抑制酪氨酸酶活性［64］、抗菌消炎［65］等作用。目前，并無直接提取甘草查爾酮A 的方法，一般是先提取甘草總黃酮，再分離得到該成分，通常是幾種方法聯(lián)合應(yīng)用。

Luo 等［35］將甘草粗提物經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺層析后，甘草查爾酮A 純度可達80.28%；韓龍哲等［66］將甘草總黃酮先經(jīng)硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（9∶1）為洗脫劑梯度洗脫，再經(jīng)聚酰胺柱色譜分離，以甲醇-水（6∶4）為洗脫劑梯度洗脫，洗脫部分經(jīng)重結(jié)晶后得甘草查爾酮A；鞠偉會等［67］將甘草總黃酮經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺層析柱純化后，再用乙醇重結(jié)晶，甘草查爾酮A 純度可達95%以上。

5 結(jié)語與展望

目前，對甘草黃酮的提取已逐漸向低能耗、綠色環(huán)保、高提取率的方向發(fā)展，如超聲輔助提取法［13-14，46］、雙水相提取法［23］、超臨界CO2萃取法［26，58］等，但如何將其規(guī)模從實驗室小試擴大至中試車間，最終應(yīng)用到實際生產(chǎn)仍需進行研究。同時，在上述操作過程中仍以甘草酸、甘草次酸等皂苷類成分開發(fā)利用為主，藥渣中的黃酮有待進一步開發(fā)利用。另外，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如何根據(jù)甘草中皂苷、黃酮、多糖本身的特點來研發(fā)節(jié)能環(huán)保高效的同時提取分離技術(shù)也應(yīng)作為以后考察方向之一。

目前，甘草黃酮主要分離方法為大孔吸附樹脂法［60，66，68-69］、聚酰胺柱色譜法［29，49］等，但目前大多以單一成分為目標(biāo)，如何分離所有成分是今后研究的重點，同時尋找到適合其工業(yè)化的分離方法也是未來目標(biāo)之一。近年來，模擬移動床色譜法［50］、離子液萃取法［51］、膜分離法［52］等新方法層出不窮，可不斷探索它們在甘草黃酮分離中的應(yīng)用，尋找到更環(huán)保高效、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的手段。