片仔癀調控腫瘤細胞凋亡與增殖的途徑

劉妙華，周步高，欒思宇，劉馥春，劉端勇，趙海梅

（1.江西中醫藥大學，江西南昌 330004；2.江西中醫藥大學科研處，江西南昌 330004；3.江西中醫藥大學科技學院，江西南昌 330004；4.江西中醫藥大學中醫學院，江西南昌 330004）

片仔癀為我國傳統名貴中成藥之一，主要由牛黃、天然麝香、三七、蛇膽等名貴藥材煉制而成，具有清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛的功效［1］?，F代藥理研究證實，片仔癀有著抗腫瘤、保肝護肝、抑制肝再生、解熱抗炎、腦保護、促進乙醇代謝等作用，臨床上肝癌、結腸癌、食道癌、肝炎等疾病均可用其來治療［2］。

近年來，調控腫瘤細胞凋亡與增殖的途徑在各種癌癥發病及其治療中的作用是當前研究熱點之一。細胞凋亡［3］是機體為穩定內環境所進行的主動消亡過程，可通過細胞線粒體、細胞內質網應激、死亡受體等通路介導的機制發生凋亡，其中前兩者屬于內源性凋亡通路，而后者屬于外源性凋亡通路。它有助于維持機體內細胞數量動態平衡，保證器官組織生長發育、免疫系統、新陳代謝、非正常細胞清除的正常運營，對生理性胚胎發育、免疫細胞分化、自身免疫系統維持、腫瘤發生、神經系統損傷等具有重要意義［4］；細胞增殖也是生物體中的重要生命特征之一，主要以細胞分裂的方式源源不斷地產生新細胞，以替換體內衰老或死亡的細胞；并且其與增殖之間的相互作用是生物體內細胞正常新陳代謝、維持機體細胞數量動態平衡的重要機制［5］，當這種動態平衡被打破、調控基因異常表達時，會導致細胞凋亡被抑制，細胞無限增殖分化，從而產生腫瘤細胞，故誘導腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞增殖是相關治療的重要途徑［6］。本文就片仔癀調控腫瘤細胞凋亡與增殖的途徑作一綜述，以期為該方的保護和進一步開發提供依據。

1 片仔癀對腫瘤細胞凋亡與增殖的調控效果

1.1 促進腫瘤細胞凋亡 細胞凋亡是一種自主的有序性死亡，由基因控制為穩定機體內環境而進行的生物學現象。陳炳藝［7］觀察Hoechst 33342 染色后的MG63／ADM 細胞發現，片仔癀干預后細胞核相繼呈現胞核聚縮、月牙狀改變、典型凋亡小體的現象，提示該方可使MG63／ADM 細胞凋亡加速。在片仔癀調控人卵巢癌OVCAR-3 細胞凋亡實驗［8］中，流式細胞術檢測結果顯示對照組中OVCAR-3 細胞早期凋亡率為0，而經過250、500、1 000 μg／mL 片仔癀處理24 h后，其凋亡率分別6.6%、30.9%、43.2%，呈現明顯的劑量依賴性，也提示了該方可促進OVCAR-3 細胞凋亡。

1.2 抑制腫瘤細胞增殖 細胞增殖是機體生長、發育、繁殖以及遺傳過程中不可或缺的一部分。在片仔癀對大腸癌細胞HT-29、HCT-8／5-FU 和HCT-8 細胞生長的研究中，MTT 實驗結果顯示該方能明顯地抑制HT-29、HCT-8／5-FU、HCT-8 細胞增殖，并具有明顯的劑量依賴性［9-10］；HCT-8／5-FU 細胞數明顯減少，體積也有不同程度的縮小，甚至發生懸浮、脫落而死亡的現象，均與藥物劑量呈正相關，進一步證實了該方對人結直腸癌細胞的增殖有抑制作用。

2 片仔癀調控腫瘤細胞凋亡與增殖的途徑

2.1 激活線粒體凋亡途徑 線粒體在作為細胞呼吸鏈和氧化磷酸化核心的同時，更是扮演著脊椎動物細胞凋亡中樞調控者的角色。在線粒體膜內外Bcl-2 家族成員的相互介導下，可導致線粒體膜通透性發生變化，跨膜電位下降，細胞色素C 和其他蛋白從線粒體膜內向外釋放，最終激活線粒體凋亡途徑［11］。張燕等［12］在片仔癀影響骨肉瘤U2OS細胞實驗中發現，細胞線粒體膜電位可被不同劑量片仔癀降低，并與其劑量呈正相關，降低率分別為10.07%、19.57%、24.90%，并隨著其劑量升高凋亡率明顯上升，表明該方可呈劑量依賴性地下調線粒體膜電位，從而介導骨肉瘤U2OS 細胞凋亡。

2.2 抑制STAT3 途徑 STAT3 信號被激活后，可轉位進入細胞核內與DNA 的反應原件聯合，參與細胞的生長、分化、增殖、凋亡等一系列生理過程［13］，但其持續性激活可促進細胞增殖，加速惡性轉化，抑制細胞凋亡，導致腫瘤發生發展，而且Bcl-2、Bcl-xl 等抗凋亡基因的表達會隨著STAT3 信號的激活被促進，進而抑制腫瘤細胞的凋亡。研究表明，片仔癀可呈劑量依賴性地降低p-STAT3、Bcl-2 表達，從而達到抑制舌鱗癌Tca8113 細胞增殖的作用［14］，可能是通過抑制STAT3 通路來實現。

2.3 抑制PI3K／Akt 通路 PI3K／Akt 信號通路在調控細胞生長增殖、阻礙細胞凋亡的過程中承擔著重要作用，并且在多種腫瘤中異常表達［15］。Akt 作為PI3K 信號通路中的關鍵因子，其磷酸化水平提高可導致其下游蛋白分子（如Bad、caspase-9、NF-κB、mTOR 等）發生一系列變化，引起細胞增殖、分化、凋亡效應［16］，同時抑癌基因類脂磷酸酶PTEN 可使Akt 的磷酸化被阻斷，使PI3K／Akt 信號通路失活，導致細胞凋亡［17］。陳炳藝等［18］報道，片仔癀處理48 h 后可明顯上調PTEN 在人骨肉瘤耐藥細胞MG63／ADM中的表達，并下調p-Akt 表達，表明該方可通過影響PTEN、p-Akt 表達來調控PI3K／AKT 信號通路，從而達到抑制MG63／ADM 細胞增殖、促進凋亡的效果；林海英等［19］也證實了片仔癀干預后可使PI3K、p85α、Akt 蛋白磷酸化被抑制，導致PI3K／Akt 信號失活，最終誘導骨肉瘤U2OS 細胞凋亡。

2.4 抑制Notch 通路 Notch 信號通路屬于跨膜受體信號通路家族，具有高度保守性，對細胞增殖、分化、凋亡所發揮的關鍵調控作用主要是通過介導細胞間相互作用實現的，它主要由Notch 受體、配體、調節因子、相關轉錄因子等組成［20］，其配體與受體相結合后被激活，可引起Notch 蛋白裂解，并轉移至細胞核，與轉錄因子RPB-Jκ 結合形成復合物，從而激活其下游靶基因Hes、Hey、Herp 等轉錄與表達，最終引起細胞分化、增殖、凋亡等過程［21］。研究表明，片仔癀能顯著抑制大腸癌干細胞中Notch1 和Hes1 的表達，并隨其劑量增加而細胞增殖率下降，提示該方可能是通過調控Notch 通路來抑制大腸癌干細胞的增殖，促進大腸癌干細胞的凋亡及分化［22］。

2.5 抑制Wnt／β-catenin 通路 Wnt／β-catenin 通路是一條高度保守的信號通路，與細胞增殖分化和機體平衡密切相關［23］，亦是調控大腸癌干細胞生長的主要通路之一［24］，大腸癌干細胞增殖及致瘤都與其相關。其中，β-catenin 是該通路發揮調節作用的關鍵蛋白，有研究發現Lgr-5 是大

腸癌干細胞的重要標記蛋白，也是維持其致瘤性的關鍵因子［25］。魏麗慧［26］報道，片仔癀干預后的大腸癌干細胞密度減少，活力及成瘤能力均下降，與對照組相比β-catenin、Lgr-5 的mRNA 及蛋白表達明顯降低，表明該方可通過抑制Wnt／β-catenin 通路來達到抑制大腸癌干細胞增殖的效果。

3 片仔癀調控細胞凋亡與增殖的相關基因與蛋白

3.1 Caspase 家族 Caspase 家族是引起細胞凋亡的關鍵調控蛋白酶之一，被相關信號通路激活后能使Caspase 隨之進入級聯反應，降解細胞內蛋白質，引發細胞凋亡行為。研究表明，隨著片仔癀劑量的逐漸增加，骨肉瘤MG63 細胞中caspase-3、caspase-9 表達均明顯提升，提示該方能通過調控caspase-3、caspase-9 表達來誘導骨肉瘤MG63 細胞凋亡［27］。Lin 等［28］也證實了片仔癀能呈劑量依賴性地激活caspase-3 的表達，刺激細胞凋亡的分子級聯效應，誘導人類結腸癌HT-29 細胞株死亡。

3.2 Bcl-2 家族 Bcl-2 家族能調控線粒體中細胞色素C 等凋亡基因的釋放，是線粒體參與的凋亡途徑中的關鍵效應因子，可通過多種途徑來介導細胞凋亡，如線粒體、細胞內Ca2+水平、氧化自由基（ROS）、Bcl-2／Bax 等。實驗表明，骨肉瘤MG63 細胞經片仔癀處理后，Bcl-2 蛋白表達呈明顯的下降趨勢，而Bax 表達明顯升高，并且隨著其劑量增加Bax／Bcl-2 也逐漸上升［27］，提示該方可通過調控Bcl-2、Bax 表達來促進MG63 細胞凋亡，進而發揮抗腫瘤作用。

3.3 p53 蛋白家族 p53 蛋白家族在預防癌癥方面起著重要作用，能在細胞有絲分裂G 期監視DNA 完整性，是一種抑癌基因，若監測到有損傷，則促使細胞自我修復；但若損傷過大，則不能完全復原DNA，p53 會誘導其凋亡。有研究發現絕大多數大腸癌患者組織和細胞中PNO1 基因的表達往往會有顯著性的升高，且實驗表明通過片仔癀處理可使PNO1沉默并激活P53 通路，導致P53 及其下游P21 表達明顯上調［29］，進而誘導細胞凋亡，達到抑制腫瘤生長的目的。

3.4 Ki-67、HGF mRNA Ki-67 是細胞增殖的標志物，它除了在細胞靜止期G0期不表達外，在細胞分裂的G1、S、G2、M 期中均有表達［30-31］。在片仔癀預處理后的70%肝切除小鼠中發現，肝組織中Ki-67、肝細胞生長因子（HGF）mRNA 表達明顯下降，表明該方能抑制殘余肝組織細胞的增殖［32］；莊群川等［9］在片仔癀干預后的移植瘤組織中發現，Ki-67 蛋白表達明顯下降，表明該方可通過下調Ki-67蛋白水平來抑制腫瘤細胞增殖。

4 展望

片仔癀可通過激活線粒體凋亡途徑、抑制STAT3 通路、PI3K／Akt 通路、Notch 通路、Wnt／β-catenin 通路等多種途徑及相關靶基因與蛋白來影響腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲等過程，而這些信號調控腫瘤細胞增殖與凋亡引起的功能與狀態紊亂在自身免疫性疾病、癌癥等發生過程發揮了重要角色，可為該方治療包括腫瘤在內的其他疾病、拓展其臨床主治范圍提供了參考依據。另外，這幾條通路存在多個關聯點［33-38］，并最終都能起到調控腫瘤細胞增殖與凋亡的作用（圖1），但它們之間具體是如何關聯起來發揮調控作用尚不明確，這也是今后課題組研究方向。

圖1 片仔癀調控腫瘤細胞凋亡與增殖相關信號通路的關聯圖

目前，關于片仔癀調控細胞凋亡與增殖方面的研究尚停留在以腫瘤為主的信號通路干預方面，而對該方調控的明確靶點和相關基因、腫瘤和炎癥微環境、與細胞凋亡密切相關的細胞自噬和焦亡、調控細胞凋亡與增殖的有效組分和部位等方面的研究還不夠深入，也不夠明確，而且是否具有更加適宜的劑型也是目前困擾相關新藥研發的關鍵性問題。因此，加快片仔癀在其他疾病細胞凋亡與增殖方面中的藥理學研究、有效組分和部位的篩選挖掘、劑型改造等對保護和開發該方具有深遠而現實的意義。