不同干燥方式對川芎多糖理化性質及抗氧化活性的影響

陳 歡，姜媛媛?，徐 峰，張 利，胡 佳，吳金勇，王海平

（1.四川農業大學理學院，四川雅安 625014；2.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川成都 611731）

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，具有祛風止痛、活血祛瘀的功效［1］，富含多糖、生物堿、揮發油、內酯等多種化學成分，廣泛應用于心血管疾病的預防與治療［2］。多糖作為川芎主要活性成分之一，主要由木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖組成［3］，具有抗菌、抗氧化、抑制肝癌細胞HepG2 增殖［4］等活性，目前已成為研究熱點，具有開發利用的潛力。

多酚、黃酮、花青素、多糖［5］等天然活性成分在清除自由基、防止生物體內過氧化中發揮重要作用，可作為潛在的新型天然抗氧化劑。多糖生物活性與其分子結構、水溶性、分子量、黏度等性質密切相關［6］，主要受樣品處理方法、提取工藝、干燥方式等因素的影響［7］，其特征結構的破壞可能會導致其生物活性顯著下降。目前，多糖制備過程中常用的干燥方式有冷凍干燥、真空干燥、熱風干燥，其中熱風干燥在食品工業中應用最廣泛，成本也最低廉，但在高溫有氧條件下會破壞多糖品質和活性；真空干燥在除去水分的同時可防止多糖與氧氣結合而發生氧化，但生產效率低；冷凍干燥通過升華除去物質中水分，在低溫缺氧條件下可抑制微生物生長、酶反應，從而生產出高品質多糖。目前，對川芎多糖的研究主要集中在提取、分離、純化、活性等方面，但尚無干燥方式對該成分理化性質、抗氧化活性影響的報道。

因此，本實驗比較熱風干燥、真空干燥、冷凍干燥所得川芎多糖在理化性質、抗氧化活性方面的差異，進而探討不同干燥方式對該成分理化性質、抗氧化活性的影響，為其進一步開發利用提供理論依據。

1 材料

1.1 藥材 川芎采自四川綿竹川芎高效種植示范基地，經四川農業大學生命科學學院楊瑞武教授鑒定為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.，洗凈后50 ℃下烘干，粉碎，過60 目篩，干燥保存。

1.2 試劑與藥物 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、四唑氮藍（NBT）、還原型輔酶I 鈉鹽（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）均為分析純，購于美國Sigma-Aldrich 公司。葡萄糖、苯酚、無水乙醇均為分析純，濃硫酸為優級純，購于成都市科龍化工試劑有限公司。

1.3 儀器 CP-114 電子天平，購于上海洪紀儀器設備有限公司；SB-600DTD 超聲波清洗機，購于寧波新芝生物科技股份有限公司；透析袋（截留分子量8 000 Da），購于成都市科龍化工試劑有限公司；LGJ-12 冷凍干燥機，購于北京松源華興科技發展有限公司；GL-22MS 高速冷凍離心機，購于匡貝實業有限公司；DZ-2BC 真空干燥箱，購于天津泰斯特儀器有限公司；DGZ-9240 電熱恒溫鼓風干燥箱，購于上海一恒科技有限公司；FTIR-8400S 紅外光譜儀，購于日本Shimadzu 公司。

2 方法

2.1 川芎多糖制備 采用超聲波聯合熱水浸提法提取多糖。準確稱取50 g 藥材粉末，置于圓底燒瓶中，以1∶16料液比加水，超聲（40 kHz、200 W）處理17 min，置于60 ℃恒溫水浴中提取4.3 h，提取液真空濃縮后Sevage 法脫蛋白，蒸餾水透析48 h，透析液真空濃縮至原體積的1／10，4 倍量乙醇沉淀，離心后收集沉淀，分別采用熱風干燥（60 ℃）、真空干燥（60 ℃，0.06 MPa）、冷凍干燥（-40 ℃，100 Pa）干燥至含水量小于10%［8］，即得，計算得率，公式為得率＝粗多糖質量／藥材粉末質量×100%。

2.2 含水量測定 準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各1 g 至稱量瓶中，置于120 ℃恒溫干燥箱中干燥2 h。移入干燥器內冷卻至室溫，反復稱定質量至恒重，計算含水量，公式為含水量＝ ［（M1-M2）／（M1-M0）］×100%。其中，M0為稱量瓶質量（g），M1為干燥前多糖、稱量瓶總質量（g），M2為干燥后多糖、稱量瓶總質量（g）。

2.3 總糖、糖醛酸、蛋白質含量測定

2.3.1 總糖 采用苯酚-硫酸法［9］。以葡萄糖質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝5.535X+0.202 5（R2＝0.998 0），在0.005～0.05 mg／mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.2 糖醛酸 采用硫酸-咔唑法［10］。以半乳糖醛酸質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝3.405X-0.061 3（R2＝0.999 0），在0.02～0.1 mg／mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 蛋白質 采用考馬斯亮藍G-250 法［11］。以蛋白質質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝5.165X-0.025 3（R2＝0.999 0），在0.02～0.1 mg／mL范圍內呈良好的線性關系。

2.4 淀粉、酚羥基鑒定 采用I2-KI 試驗鑒定淀粉，FeCl3顯色反應鑒定酚羥基。

2.5 紅外光譜分析 準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各2 mg，加入100 mg KBr 充分研磨，壓片，置于FTIR中，在4 000～450 cm-1波數范圍內掃描，觀察譜峰［12］。

2.6 抗氧化活性研究

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 參照Hu 等［13］報道的方法。準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各0.3 g，制成0～3.0 mg／mL 樣品溶液，與2 mL DPPH 乙醇溶液（0.2 mmol／L）混合，室溫下暗處反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度，重復3 次，取平均值，計算清除率，公式為清除率＝ ［（A對照-A樣品）／A對照］×100%。其中，A對照為蒸餾水替代樣品溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液或維生素C 溶液的吸光度。

2.6.2 羥基自由基清除能力 參照Hao 等［14］報道的方法。準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各0.4 g，制成0～4.0 mg／mL 樣品溶液，依次加入1.5 mmol／L 鄰二氮菲溶液1.0 mL、0.2 mol／L 磷酸鹽緩沖溶液（pH ＝7.4）2.0 mL、1.5 mmol／L 硫酸亞鐵溶液1.0 mL、樣品溶液1.0 mL、0.01% H2O2溶液1.0 mL，在37 ℃恒溫下水浴1 h，于536 nm 波長處測定吸光度，重復3 次，取平均值，計算清除率，公式為清除率＝ ［（A樣品-A空白）／（A對照-A空白）］×100%。其中，A對照為蒸餾水替代樣品溶液的吸光度，A樣品為樣品溶液或維生素C 溶液的吸光度，A空白為不加雙氧水的混合反應溶液的吸光度。

2.6.3 超氧陰離子清除能力 參照Xu 等［15］報道的方法，采用氮藍四唑（NBT）法測定。準確稱取熱風、真空、冷凍干燥所得多糖各0.3 g，制成0～3.0 mg／mL 樣品溶液，加入樣品溶液1.5 mL、300 μmol／L NBT 溶液0.50 mL、468 μmol／L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型輔酶Ⅰ（NADH）溶液0.50 mL、60 μmol／L 過硫酸氫鉀（PMS）溶液0.50 mL，在25 ℃下恒溫5 min，于700 nm 波長處測定吸光度，0.15 mol／L PBS 溶液（pH ＝7.6）代替樣品溶液作為空白對照，重復3 次，取平均值，計算清除率，公式為清除率＝ ［（A對照-A樣品）／A對照］×100%。其中，A樣品為樣品溶液或維生素C 溶液的吸光度，A對照為PBS 溶液的吸光度。

2.7 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（）表示。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 不同干燥方式對川芎多糖理化性質的影響

3.1.1 外觀色澤、成分組成 表1 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖均為淡黃色固體，無臭無味，KI、FeCI3反應均呈陰性，表明均為不含酚類的非淀粉類多糖；冷凍干燥下多糖得率顯著高于真空、熱風干燥下（P＜0.05），并且總糖含量最高，而熱風干燥下總糖含量最低；多糖均含有一定量糖醛酸、蛋白質，表明均含有少量蛋白質的酸性成分；真空干燥下多糖糖醛酸含量最高，冷凍干燥下最低，熱風、冷凍干燥下無明顯差異（P＞0.05）；冷凍干燥下蛋白質含量高于熱風、真空干燥下（P＜0.05）。

表1 不同干燥方式對川芎多糖理化性質的影響（）

表1 不同干燥方式對川芎多糖理化性質的影響（）

注：同一列不同小寫字母表示差異有統計學意義（P＜0.05）。

3.1.2 紅外光譜 圖1 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖都有明顯特征吸收，其中3 353 cm-1附近的寬峰是由O-H 伸縮振動吸收產生，表明存在分子間氫鍵；2 925 cm-1附近為C-H 伸縮振動吸收峰［16］；在1 735 cm-1處的吸收為羰基-C＝O 的伸縮振動吸收峰；在1 640 cm-1處的吸收峰是由-OH 的彎曲振動產生；1 410 cm-1附近為-CH2的變形吸收峰；1 024 cm-1附近的吸收峰是由吡喃糖環醚鍵（C-O-C）、醇羥基的變角振動產生［17］；930 cm-1附近的吸收峰為吡喃環振動的特征吸收；在870 cm-1處為β-糖苷鍵的吸收峰，表明川芎多糖由β-吡喃糖苷鍵連接。

圖1 川芎多糖紅外光譜圖

3.2 不同干燥方式對川芎多糖抗氧化活性的影響

3.2.1 DPPH 自由基清除能力 圖2 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖對DPPH 自由基的清除率均隨其質量濃度（0～3.0 mg／mL）增加而逐漸升高，分別達到76.32%、80.74%、85.29%；當多糖質量濃度小于2.0 mg／mL 時，其清除率上升較快，而在2.0～3.0 mg／mL 時上升程度較平緩；3 種干燥方式下IC50分別為1.71、1.58、1.37 mg／mL，表明冷凍干燥多糖清除DPPH 自由基的能力強于熱風、真空干燥。

3.2.2 羥基自由基清除能力 圖3 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖對羥基自由基的清除率均隨其質量濃度增加而升高，IC50分別為3.01、2.91、2.74 mg／mL；當多糖質量濃度為4.0 mg／mL 時，3 種干燥方式下清除率分別達64.81%、67.23%、71.48%，表明冷凍干燥多糖對羥基自由基的清除能力最強。

圖2 川芎多糖對DPPH 自由基的清除率

圖3 川芎多糖對羥基自由基的清除率

3.2.3 超氧陰離子清除能力 圖4 顯示，熱風、真空、冷凍干燥所得多糖對超氧陰離子的清除率均隨其質量濃度（0～3.0 mg／mL）增加而升高，清除率分別達55.65%、52.72%、58.89%；當多糖質量濃度小于2.0 mg／mL 時，清除率上升較快，而在2.0～3.0 mg／mL 時上升程度較平緩；3種干燥方式下IC50值分別為3.15、3.38、2.71 mg／mL，表明冷凍干燥多糖對超氧陰離子的清除能力最強。

4 討論與結論

多糖是具有多種生物活性的天然高分子化合物，其抗氧化活性、理化性質與空間構象有關［18］，而干燥方式作為該成分制備過程中的一個重要環節，可通過影響其理化性質而進一步影響其生物活性［19］。本實驗發現，冷凍干燥、真空干燥、熱風干燥所得川芎多糖在外觀色澤、氣味方面無差異，均不含淀粉、酚類；冷凍干燥下總糖含量最高，熱風干燥下最低；真空干燥下糖醛酸含量最高，其他2 種方法下無明顯差異；冷凍干燥下蛋白質含量最高，明顯高于真空、熱風干燥下。段夢穎等［20］發現，干燥方式對聚合草多糖理化性質有顯著影響，其中冷凍干燥總糖含量最高。

圖4 川芎多糖對超氧陰離子的清除率

研究表明，多糖中的-OH、-COOH、-C ＝O 等官能團均與其抗氧化活性有關［24］。本實驗發現，冷凍干燥下總糖含量顯著高于真空、熱風干燥下，其較高的抗氧化活性可能與含有更多-OH、-C＝O 官能團有關。另外，多糖對自由基清除能力的強弱還與其所含蛋白質含量有關，其中的氨基酸可與羥基自由基相互作用，形成穩定的大分子自由基，從而達到清除自由基的效果［25］。但高溫等外界條件會導致糖結合蛋白變性，可能會引起多糖構象受損，進而使其清除自由基活性降低［19］，由于真空、熱風干燥所需溫度較高，可能會導致多糖中結合蛋白變性，從而降低其抗氧化活性。喻俊等［22］發現，與熱風、真空干燥比較，冷凍干燥下牛蒡多糖中蛋白質含量最高，抗氧化活性最強；Yang等［26］報道，超聲波輔助亞臨界水提取枸杞多糖中較高的蛋白質含量可能增強其抗氧化活性。另外，多糖結構上連接的糖醛酸可與蛋白質等其他成分結合起來，從而呈現各種活性［18］。本實驗發現，冷凍干燥下抗氧化活性較強，可能與其含有較高總糖、蛋白質含量有關，同時糖醛酸會與部分蛋白質結合，進一步增強該活性。但也有研究指出，多糖抗氧化活性還與其分子量、三螺旋結構有關［27］，故川芎多糖抗氧化活性的機制還有待進一步研究。

熱風、真空、冷凍干燥所得川芎多糖均為無臭無味的淡黃色固體，是不含多酚類的非淀粉類多糖。其中，冷凍干燥下總糖、蛋白質含量最高，分別為（87.72±1.45）%、（1.59±0.17）%；真空干燥下糖醛酸含量最高，為（2.66±0.09）%；3 種干燥方式下川芎多糖均具有較強的體外抗氧化活性，由高到低依次為冷凍干燥、真空干燥、熱風干燥。

綜上所述，川芎多糖具較強的抗氧化活性，今后可加強該成分在畜牧飼料中的應用研究。同時，冷凍干燥可作為制備優質功能性川芎多糖較好的干燥方式。