連梅顆粒對2 型糖尿病GK 大鼠的降糖作用

吳光超 楊 濤 鄭紹琴蘇穎杭付 琳王 琪鄧長生徐志勇張紅英宋健平?

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技園產(chǎn)業(yè)園，廣東廣州 510445；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006）

糖尿病是一種代謝性疾病，其特征為血糖水平升高，以2 型糖尿病為主要類型，其引起的并發(fā)癥是糖尿病患者主要死因［1］，2016 年全球患者達(dá)到4.22 億，而在我國就有1.1 億［2］。2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胰島素抵抗是其主要因素之一，故改善胰島素抵抗的藥物研究備受關(guān)注。

Goto-Kakizaki（GK）大鼠為自發(fā)型2 型糖尿病模型，是由多基因缺陷和環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致，是國際公認(rèn)較為理想模型［3-4］。連梅顆粒是國醫(yī)大師伍炳彩教授治療2 型糖尿病的經(jīng)驗方，組方思路來源于《溫病條辨》 中的連梅湯，由烏梅、麥冬、生地、黃連、山藥、玄參、黃芪、蒼術(shù)組成，對氣陰不足、虛火上炎型2 型糖尿病有明顯功效。本實驗研究連梅顆粒對2 型糖尿病模型GK 大鼠的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為中醫(yī)藥相關(guān)治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級自發(fā)性2 型糖尿病GK 大鼠，雄性，體質(zhì)量130～150 g，5～8 周齡，購自上海斯萊克試驗動物有限責(zé)任公司，單位生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2012- 0002；SPF 級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量130～150 g，5～8 周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2013-0034，均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園動物實驗中心，每籠4 只。

1.2 藥材 連梅顆粒浸膏（廣東新南方青蒿藥業(yè)有限公司，批號130916，1 kg／袋，每1 g 相當(dāng)于2.605 g 生藥），以君藥黃連中小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀含量為評價指標(biāo)，確定最優(yōu)水煎煮工藝為8 味中藥加10 倍水量煎煮3 次，每次1 h，濾液在80 ℃下濃縮成相對密度為1.25～1.30［5］。

1.3 試劑與藥物 格列齊特片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號 131101；葡萄糖（天津福晨化學(xué)試劑廠，批號20120602。大鼠胰島素檢測試劑盒（天津博瑞康生物科技有限公司，批號BRK-E80-8174061104）；大鼠糖化血紅蛋白檢測試劑盒（上海麗臣生物科技有限公司，批號05／2015）；超氧化物歧化酶（批號20150615）、丙二醛（批號20150613 試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.4 儀器 電子天平（十萬分之一，型號JJ2000，常熟市雙杰測試儀器廠）；恒溫水浴箱（型號HH-6，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司）；羅氏血糖儀及試紙（德國羅氏診斷有限公司）；酶標(biāo)儀（型號ELX800UV，美國Bio-Tek公司）；組織脫水機(jī)（型號TP1020）、石蠟包埋機(jī)（型號EG1160）、光學(xué)正立顯微鏡（型號DMLB）、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（型號RM2135）（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 造模 80 只GK 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每隔3 周檢測空腹血糖。12 周后，大鼠灌胃給予10 mL／kg 高脂乳劑，每天1 次，連續(xù)2 周，以誘導(dǎo)其自發(fā)性血糖升高。結(jié)果，有40 只FBG≥11.1 mmol／L，即符合2 型糖尿病模型，納入實驗［6］。

2.2 分組與給藥 將“2.1”項下符合成模標(biāo)準(zhǔn)的40 只GK 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組，分別為模型組、格列齊特片組及連梅顆粒高、中、低劑量組，另取SD 大鼠作為正常對照組，每組8 只。模型組、正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)及等量純凈水灌胃，格列齊特片組灌胃給藥劑量為16.67 mg／kg，連梅顆粒高、中、低劑量組灌胃給藥劑量分別為10.52、5.26、2.63 g／kg，每天1 次，連續(xù)9 周。

2.3 指標(biāo)檢測 ①給藥0、3、6、9 周，大鼠禁食不禁水12 h 后刀片劃割尾靜脈采微血，檢測空腹血糖水平；②給藥9 周，大鼠禁食不禁水12 h 后，取微血進(jìn)行糖耐量試驗（OGTT），計算曲線下面積（AUC）；③OGTT 測定完畢后，大鼠主動脈取血，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清胰島素（INS）水平，根據(jù)FBG、INS 水平計算胰島素抵抗指數(shù)（IRI）、胰島素敏感指數(shù)（ISI），公式分別為IRI ＝（FBG×INS）／22.5、ISI＝1／（FBG×INS）；④ELISA 檢測血清糖化血紅蛋白水平；⑤化學(xué)比色法檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平；⑥采全血后快速剖取胰腺，固定于10%中性福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟包埋，HE 染色，正置顯微成像系統(tǒng)觀察胰島細(xì)胞組織形態(tài)、體積、排列等情況。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般癥狀 正常組大鼠體形、飲食、大小便均正常，較為活躍，毛色光澤；模型組大鼠體形較瘦，反應(yīng)遲鈍，毛色枯槁，有脫毛現(xiàn)象，明顯出現(xiàn)多飲多尿癥狀；與模型組比較，給藥組大鼠多飲多尿癥狀明顯改善。

3.2 連梅顆粒對大鼠空腹血糖的影響 給藥前，與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠空腹血糖無明顯變化（P＞0.05）。給藥6周后，與模型組比較，各給藥組（除連梅顆粒低劑量組）大鼠空腹血糖降低（P＜0.05，P＜0.01）。給藥9 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠空腹血糖降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 連梅顆粒對大鼠空腹血糖的影響（， n＝8）

表1 連梅顆粒對大鼠空腹血糖的影響（， n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.3 連梅顆粒對大鼠糖化血紅蛋白水平的影響 給藥9 周后，與正常組比較，模型組大鼠糖化血紅蛋白水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，連梅顆粒低、高劑量組大鼠糖化血紅蛋白水平降低（P＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯。見表2。

3.4 OGTT 試驗 給藥9 周后，與模型組比較，各給藥組對糖耐量減損的血糖升高有抑制作用（P＜0.05），以連梅顆粒中劑量組、格列齊特片組更明顯（P＜0.01）；格列齊特片組曲線下面積最?。≒＜0.01）。見表3。

表2 連梅顆粒對大鼠糖化血紅蛋白水平的影響（，n＝8）

表2 連梅顆粒對大鼠糖化血紅蛋白水平的影響（，n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

表3 各組OGTT 試驗結(jié)果（， n＝8）

表3 各組OGTT 試驗結(jié)果（， n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.5 連梅顆粒對大鼠血清INS 水平及IRI、ISI 的影響 正常組大鼠血清INS 水平高于其他組（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清INS 水平無明顯變化（P＞0.05），但連梅顆粒高劑量組、格列齊特片組IRI 降低（P＜0.05，P＜0.01），ISI 升高（P＜0.05）。見表4。

表4 連梅顆粒對大鼠血清INS 水平及IRI、ISI 的影響（， n＝8）

表4 連梅顆粒對大鼠血清INS 水平及IRI、ISI 的影響（， n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3.6 連梅顆粒對大鼠血清SOD 活性及MDA 水平的影響與正常組比較，模型組大鼠血清SOD 活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清SOD 活性升高（P＜0.01）。與正常組比較，模型組MDA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，連梅顆粒中、高劑量組及格列齊特片組大鼠血清MDA 水平降低（P＜0.01）。見表5。

表5 連梅顆粒對大鼠血清SOD 活性及MDA 水平的影響（， n＝8）

表5 連梅顆粒對大鼠血清SOD 活性及MDA 水平的影響（， n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0. 05；與模型組比較，##P＜0.01.

3.7 大鼠胰腺病理組織學(xué) 與正常組比較，模型組大鼠胰島細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，與周圍組織界限不清晰，胰島內(nèi)出現(xiàn)胰島細(xì)胞核密集現(xiàn)象，但未見明顯空泡性和細(xì)胞壞死現(xiàn)象（圖1A～1B）；與模型組比較，連梅顆粒各劑量組大鼠胰島形態(tài)基本規(guī)則，邊界稍清晰，未見細(xì)胞核密集現(xiàn)象，胰島細(xì)胞排列較整齊，可見散在的胰島細(xì)胞呈團(tuán)狀增殖，而且高劑量組胰島體積形態(tài)較規(guī)則，胰島細(xì)胞數(shù)目最多（圖1C～1E）；格列齊特片組大鼠胰島形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，但胰島細(xì)胞數(shù)目較少（圖1F）。

圖1 各組大鼠胰島組織病理變化（HE，×100）

4 討論

2 型糖尿病是由胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗引起血糖升高的代謝性疾病，其發(fā)生大多與遺傳、環(huán)境因素相關(guān)［7］。GK 大鼠屬于自發(fā)型的2 型糖尿病模型，其發(fā)病機(jī)制與人類相似，是Goto 等［8］用Wistar 大鼠近交數(shù)代重復(fù)繁殖而來。連梅顆粒是以連梅湯為基礎(chǔ)化裁而來，后者出自《溫病條辨》 暑溫伏暑第36 條，云“暑邪深入少陰消渴者，連梅湯主之”，而消渴正是2 型糖尿病主要癥狀之一，原方中烏梅合黃連酸苦泄熱，烏梅合麥冬、生地、阿膠酸甘化陰，用于治療上有心火亢盛、下有肝腎陰虧之證，伍炳彩教授匠心獨運，在其基礎(chǔ)上去阿膠之溫?zé)?，加玄參之涼潤，合黃芪益氣健脾、山藥滋養(yǎng)脾陰、蒼術(shù)運脾化津，全方共奏滋腎泄熱、益氣健脾生津之功效。

持續(xù)高血糖是糖尿病發(fā)病主要特點，臨床上常以糖化血紅蛋白來反映患者近期血糖控制水平。本實驗發(fā)現(xiàn)，不同劑量連梅顆粒均能夠明顯降低大鼠空腹血糖，以高劑量組降低HbAlc 水平程度最大，并存在一定劑量依賴性。

國內(nèi)外研究表明，胰島β 細(xì)胞功能損傷是導(dǎo)致糖耐量受損轉(zhuǎn)變?yōu)樘悄虿〉母疽蛩?，故控制血糖升高、促進(jìn)胰島β 細(xì)胞增殖分化是治療糖尿病的關(guān)鍵［9-10］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠葡萄糖耐受能力、胰島素水平、胰島抵抗、敏感指數(shù)明顯降低，符合2 型糖尿病發(fā)病特點；給藥9 周后，與模型組比較，各給藥組大鼠INS 無明顯變化，但OGTT實驗結(jié)果顯示各給藥組能明顯抑制血糖升高，其中連梅顆粒高劑量組、格列齊特片組還可明顯降低胰島素抵抗，提高胰島素敏感。格列齊特片是臨床常用口服降糖藥，為WHO 推薦的胰島素促泌劑［11］，而高劑量連梅顆粒也能促進(jìn)胰島素分泌，改善胰島素抵抗，增加胰島素敏感。

胰島素是唯一有效的降糖激素，僅由胰島β 細(xì)胞合成分泌，文獻(xiàn)［12-13］報道β 細(xì)胞具有一定自我修復(fù)能力，但長期高血糖狀態(tài)引發(fā)氧化應(yīng)激功能失調(diào)會誘發(fā)其凋亡。血清SOD 是一種能消除體內(nèi)自由基的抗氧化酶，可有效消除活性氧、活性氮，從而減少細(xì)胞損傷；MDA 為脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，是反映體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)，本實驗發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠SOD 活性明顯降低，MDA 水平明顯升高，進(jìn)一步驗證氧化應(yīng)激反應(yīng)參與2 型糖尿病形成。高血糖可刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的自由基，從而誘發(fā)多價不飽和脂肪酸生成過氧化脂質(zhì)，導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞生物膜變性死亡［14］，而連梅顆粒能提高GK 大鼠血清SOD 活性，降低MDA 水平，從而減輕因氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致胰島細(xì)胞損傷。HE 染色發(fā)現(xiàn)，不同劑量連梅顆粒均能抑制胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖分化，對其有一定保護(hù)和修復(fù)功能。

綜上所述，連梅顆粒可降低2 型糖尿病GK 大鼠空腹血糖、HbA1c 水平，改善糖耐量減損后血糖升高，并呈一定劑量依賴性，其作用機(jī)制可能是通過抗氧化機(jī)制來保護(hù)胰島細(xì)胞功能，同時改善胰島抵抗，促進(jìn)胰島素釋放，但具體分子機(jī)制仍需作進(jìn)一步研究。