藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用

陳發(fā)菊 彭 梅 王 麗楊 艷李立郎王 瑜楊小生?

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550014）

隨著人們生活水平的提高，越來越多的人習(xí)慣飲酒，但長期飲酒所致酒精性肝病的發(fā)病率和死亡率最高，患者脂肪會變性，10%～35%引發(fā)成肝炎，其中8%～20%最終轉(zhuǎn)化為肝硬化［1-5］。酒精性肝病嚴(yán)重影響人們的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)及健康狀況，到目前為止沒有藥物能有效治療［6］。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是酒精性肝病受損的主要發(fā)病機(jī)制之一［7］。

藤茶系葡萄科蛇葡萄植物顯齒蛇葡萄［Ampelopsisgrossedntata（Hand-Mazz）W.T.Wang］的莖葉，主要分布于廣西、廣東、云南等各地區(qū)，其性味甘淡，具有清熱解毒功效，主治咽喉腫痛、感冒風(fēng)熱、黃疸型肝炎［8］?？傸S酮是從藤茶莖葉中提取的有效成分，具有抗血栓、降脂、保肝、降血糖等作用［9-12］。有研究報道，藤茶總黃酮對小鼠的拘束負(fù)荷引起的肝損傷、免疫性肝損傷及四氯化碳致急性肝損傷有保護(hù)作用，但尚未見對酒精性肝損傷有保護(hù)作用。本研究旨在通過藤茶總黃酮對酒精性小鼠肝組織病理損傷的影響，觀察其對酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藤茶總黃酮制備 藤茶來源于貴州省銅仁市梵凈山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為正品。取藥材嫩葉干燥粗粉90 g，1 899 mL 75%乙醇加熱回流提取3 次，濾過，合并濾液，減壓濃縮，冷卻后低溫放置3 d 使其充分析出沉淀，收集沉淀并反復(fù)重結(jié)晶，即得（8 g），得率為8.9%。

1.2 動物 雄性KM 小鼠，體質(zhì)量（25±5）g，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（軍）2012-0011，飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（55±5）%的清潔級動物房，控制照明時間為每天12 h，自由進(jìn)食與飲水。

1.3 試劑 習(xí)酒購于貴陽沃爾瑪超市（批號750813602S）。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶生物科技有限公司，批號20180429）；T-AOC（南京建成生物工程研究所，批號20171218）；ALT（南京建成生物工程研究所，批號20180216）；AST（南京建成生物工程研究所，批號20180416）；SOD（南京建成生物工程研究所，批號20180521）；GSH（南京建成生物工程研究所，批號20180711）；IL-4（南京建成生物工程研究所，批號20180226）；IL-6（南京建成生物工程研究所，批號20180714）；TNF-α（南京建成生物工程研究所，批號20180424）。

1.4 儀器 TP1020 自動阻止脫水機(jī)、包埋機(jī)、CM2245 輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司）；電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；W-80A 型漩渦混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；電子天平（賽多利斯電子公司）；Milli QA 純水處理器（法國Millipo Trading 公司）；電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海博訊實(shí)業(yè)公司）；離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；-80 ℃低溫冰箱（日本三洋公司）；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.5 分組及給藥 將50 只小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組及藤茶總黃酮低、中、高（50、75、100 mg／kg）給藥組，每組10 只，除正常組外各組按16 mL／kg 劑量灌胃56%白酒，每天1 次，灌酒1 h 后給藥組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，空白組、模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，連續(xù)21 d。

1.6 HE 染色 將末次灌胃結(jié)束后禁食24 h 的小鼠頸椎脫臼處死，取右葉肝臟組織，切成1 cm×1 cm，顯微鏡觀察其病理情況，并拍照記錄。

1.7 肝組織ALT、AST、SOD、MDA、GSH、T-AOC、IL-4、IL-6、TNF-α 檢測 灌胃給藥后，小鼠頸椎脫臼處死，取肝組織稱定質(zhì)量，加入9 倍量生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿后2 500 r／min 離心10 min，取上清液待測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS13.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響 各組小鼠死亡率見表1。死亡的小鼠均為灌胃后第2 天發(fā)現(xiàn)，解剖時未發(fā)現(xiàn)胸腔有淤血或胃穿孔，但胃里有大量液體，大腸內(nèi)有大量氣體而無食物存在，死前均表現(xiàn)步履蹣跚、抽搐、煩躁、肚子脹氣等現(xiàn)象。

表1 藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響（， n＝10）

表1 藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠死亡率的影響（， n＝10）

2.2 藤茶總黃酮對小鼠肝組織ALT、AST、SOD、MDA、GSH、T-AOC 的影響 如圖1 所示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織ALT、AST、MDA 水平升高（P＜0.05），而SOD、GSH、T-AOC 活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮各劑量組小鼠肝組織ALT、AST、MDA 水平降低（P＜0.05），SOD、GSH、T-AOC 活性升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 藤茶總黃酮對小鼠肝組織ALT（A）、AST（B）、SOD（C）、MDA（D）、GSH（E）、T-AOC（F）的影響

2.3 藤茶總黃酮對小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影響 如表2 所示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，藤茶總黃酮各劑量組顯示肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平降低（P＜0.05）。

表2 藤茶總黃酮對小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影響（， n＝4）

表2 藤茶總黃酮對小鼠肝組織IL-4、IL-6、TNF-α 水平的影響（， n＝4）

注：與空白組比較，?P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05。

2.4 藤茶總黃酮對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響 如圖2 所示，空白組顯示肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，無水腫現(xiàn)象及炎性細(xì)胞；模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列紊亂，大多數(shù)肝細(xì)胞呈水腫現(xiàn)象，炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞纖維化，肝組織中有大小不一的脂肪滴空泡；藤茶總黃酮低劑量、中劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞排列較整齊，肝細(xì)胞水腫現(xiàn)象、肝組織內(nèi)炎性細(xì)胞、脂肪滴空泡較模型組有所減輕；藤茶總黃酮高劑量組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊、大小均一，炎性細(xì)胞、脂肪滴空泡較模型組顯著減輕。

圖2 各組小鼠肝組織病理形態(tài)（×200）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用習(xí)酒對昆明種小鼠按體質(zhì)量進(jìn)行灌胃制成酒精性肝損傷的模型，觀察藤茶總黃酮對肝臟的保護(hù)作用。酒精性肝損傷的組織學(xué)特征主要包括肝細(xì)胞脂肪滴空泡的積累、脂肪肝（脂肪變性和炎性細(xì)胞）及肝硬化［13-14］。通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠的肝組織發(fā)現(xiàn)有大量炎性細(xì)胞和脂肪滴空泡，藤茶總黃酮給藥后此現(xiàn)象顯著減輕，提示藤茶總黃酮可能對肝臟具有保護(hù)作用。

轉(zhuǎn)氨酶參與肝臟的整個過程，肝臟出現(xiàn)問題的一個重要標(biāo)志是轉(zhuǎn)氨酶升高。ALT 主要存在于肝細(xì)胞漿，AST 主要存在于肝細(xì)胞的線粒體內(nèi)，肝細(xì)胞最敏感的兩種酶是ALT 和AST，肝細(xì)胞受損時ALT 和AST 的活性升高，能夠反映肝細(xì)胞受損的程度的大學(xué)［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組ALT 及AST 的活性較高，藤茶總黃酮給藥后活性降低。體內(nèi)自由基能通過內(nèi)源性抗氧化物酶SOD 和GSH 清除，MDA是一個通過自由基誘導(dǎo)的重要脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物被用作氧化應(yīng)激的生物標(biāo)記，組織中MDA 水平越高，氧化活性越強(qiáng)，組織受損程度越大［16］。脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物MDA可嚴(yán)重?fù)p傷肝細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肝細(xì)胞的腫脹、壞死。T-AOC 是機(jī)體內(nèi)抗氧化力量的總體體現(xiàn)，是機(jī)體對抗氧自由基的主要體系［17］。機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在密切聯(lián)系，該防御體系有酶促與非酶促兩個體系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藤茶總黃酮給藥后SOD、GSH和T-AOC 的活性明顯的活性明顯強(qiáng)與模型組，MDA 水平低于模型組。

炎癥因子參與肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展整過過程，TNF-α是由機(jī)體單核巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的具有重要生物活性的細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡等［18］，因此TNF-α 表達(dá)水平的高低可以反映肝細(xì)胞損傷程度及炎癥反應(yīng)程度的大小［19］。IL-4細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)功能，可調(diào)節(jié)T、B 淋巴細(xì)胞分化、活化過程，并可促進(jìn)Th2 細(xì)胞的免疫應(yīng)答。IL-6 參與機(jī)體的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，可通過刺激細(xì)胞生長和細(xì)胞外基質(zhì)增生，導(dǎo)致肝上皮細(xì)胞變化，IL-6 被認(rèn)為是肝臟疾病炎癥的一個重要因素［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組肝組織IL-4、IL-6 及TNF-α 水平明顯升高，藤茶總黃酮給藥后肝組織IL-4、IL-6 及TNF-α 水平降低。

綜上所述，藤茶總黃酮對肝臟具有保護(hù)作用，其可能機(jī)制與增加肝組織抗氧化酶的活性、降低脂質(zhì)過氧化水平、降低IL-4、IL-6 及TNF-α 等炎癥因子水平有關(guān)。