降脂輕身方對高脂血癥小鼠調節作用的分子機制

徐變玲王 楠張 理徐學功

（1.鄭州市中醫院，河南鄭州 450007；2.河南中醫藥大學，河南鄭州 450046）

高脂血癥是指血清中膽固醇和（或）甘油三酯水平升高，是一種發病隱匿的內分泌疾病［1］。直至2015 年，我國成人患有高脂血癥人群占總人口40.4%，并且呈現逐年增高的趨勢［2］。祖國醫學認為高脂血癥屬于本虛標實之證。本虛是指臟腑功能虛衰，以脾胃氣虛肝腎陰虛為主；標實是指痰瘀交阻而內留，以痰濁、血瘀為主［3］。降脂輕身方由蒼術、白術、茯苓、半夏、大黃、番瀉葉、牽牛子、薏苡仁、澤瀉、大腹皮、木香、枳實、陳皮、丹參、生山楂等組成。該方配伍嚴謹，治療血脂異常臨床療效確切［4］。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是指一類轉錄本長度大于200 個核苷酸單位，不編碼蛋白質的非編碼RNA［5］。lncRNA 在不同生物過程中發揮重要作用，參與了表觀遺傳、轉錄和轉錄后調控過程，并與人類的重大疾病密切相關［6］。有研究報道，lncRNA 在心血管疾病的發生與發展中起到了關鍵的作用［7］。

本實驗通過降脂輕身方對高脂血癥小鼠的降脂作用為研究對象，以mRNA 和lncRNA 的的表達芯片為研究手段，分析降脂輕身方的作用靶點及代謝通路，來探究其改善高血脂的機制，為臨床治療高脂血癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 分組與給藥 采用SPF 級C57BL／6 背景6 周齡健康雄性野生型小鼠和ApoE-／-健康雄性小鼠為研究對象，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2016-0011。適應環境1 周后，以11 只C57BL／6 小鼠為正常對照組，給予普通飲食（玉米24.5%，麩皮24.5%，大麥21%，豆餅12%，魚粉6%，其他輔料12%，不包含膽固醇或動物油等任何高脂成分）；ApoE-／-小鼠隨機分為（1）模型組，給予普通飲食；（2）給藥組，在普通飲食中加入降脂輕身方（按照成人20 粒／d 進行換算，每只1.365 g／kg，每組11 只。所有小鼠均飼養于恒溫（22 ℃）恒濕（60%）環境中，12 h 明暗交替，自由攝食、飲水，飼養16 周。小鼠禁食過夜，次日稱量體質量并記錄，眼球取血后處死，血液于室溫靜置分層后，3 500 r／min離心5 min 吸取上層血清進行檢測，手術剪打開胸腔，剪斷下腔靜脈，用鑷子捏住邊緣系膜，完整剪下整個肝臟，放入10 cm培養皿中，取肝臟中葉組織送公司測序，剩余組織保存于液氮用于后續實驗。動物實驗均于河南中醫藥大學動物實驗中心完成。

1.2 試劑與藥物 降脂輕身方是鄭州市中醫院應用多年的院內制劑（豫藥制字Z20130171 鄭），其生產工藝完備且符合GAP 標準，經檢驗合格，頒發《醫療機構制劑許可證》，編號201500102。制法為蒼術、白術、枳實粉碎成細粉，過100 目篩；茯苓等其余15 味藥材加水煎煮2 次，第1 次加10 倍水量，煎煮1.5 h，濾過，濾液濃縮至相對密度1.25（80 ℃）的浸膏，70 ℃干燥，加入上述藥物藥粉，混勻，裝膠囊。顯微鏡下發現，草酸鈣簇晶大而多，直徑20～160 μm，有的至190 μm（生大黃）；菊糖表面現放射狀紋理，小型草酸鈣方晶存在于薄壁細胞中（木香）；上下表皮細胞表面觀呈多角形，上下表皮均有平軸式氣孔，副衛細胞大多為2 個；非腺毛單細胞，基部稍彎曲；纖維周圍薄壁細胞中含草酸鈣方晶形成晶鞘纖維（番瀉葉）。取本品內容物13 g，加正已烷30 mL 超聲處理15 min，濾過，濾液水浴濃縮至約2 mL，作為供試品溶液；另取白術對照藥材0.5 g，加正己烷2 mL 超聲處理15 min，放置，取上清液作為白術對照藥材溶液；再取蒼術對照藥材0.5 g，與白術對照藥材相同的方法制成蒼術對照藥材溶液。按照薄層色譜法（2015 年版《中國藥典》 四部通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各10 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（30∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果，供試品色譜在白術、蒼術對照藥材色譜相應的位置上，顯示相同顏色的斑點。

1.3 體質量、血脂水平檢測 小鼠飼養16 周后眼眶取血處死，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、甘油三酯（（TG）、血清總膽固醇（TC）水平。

1.4 微陣列測序以及差異基因篩選 采用博奧晶典人類長鏈非編碼RNA 芯片V4 檢測。Feature Extraction 提數軟件進行預處理分析，GeneSpring GX 軟件計算基因表達差異和統計學顯著性P值。根據分組信息進行差異比較，以差異倍數FC≥2.0，P≤0.05 為標準進項篩選，得到差異基因；FC（abs）值差異倍數越大，說明兩個樣品之間的差異越大；P越小，說明差異基因的可靠性越高。采用Cluster3.0軟件，進行Cluster 分析和圖形化展示。

1.5 GO 分析 將篩選出的差異mRNA 導入https：／ ／david.ncifcrf.gov／數據庫，進行GO、KEGG 富集分析，從生物進程（biological process）、細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）3 層結構描述基因產物功能，并進行KEGG（KEGG pathway analysis）代謝通路分析。

1.6 共表達分析 共表達（correlation）分析的基本方法是將探針在各樣品中的標準化信號值作為數據源，進行兩兩相關性計算和假設驗證，得到相關系數和P值。相關性算法采用Pearson 法，P值默認不進行多重校正，其篩選標準為Correlation＞0.99 或Correlation＜-0.99，P＜0.05。挑選上述共表達結果中關聯度最大的前1 000 個關系對，采用Cytoscape 軟件繪制其網絡圖。

1.7 靶基因預測 在“1.6”項下結果的基礎上，cis-預測尋找基因組位置在10 kb 之內的lncRNA-mRNA 對，trans-預測利用blast 工具對lncRNA、mRNA（3 ‘UTR）序列進行比對，篩選序列相似的lncRNA-mRNA 對。挑選上述靶基因預測結果中關聯度最大的前1 000 個關系對，采用Cytoscape 軟件繪制其網絡圖。

1.8 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用one-way ANOVA 檢驗。P＜0.05為差異具有統計意義。

2 結果

2.1 體質量、血脂 與正常對照組比較，模型組小鼠體質量升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠體質量降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1A。與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清TC 水平降低（P＜0.05），見圖1B。與正常對照組比較，模型組小鼠血清TG 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清TG 水平降低（P＜0.01），見圖1C。與正常對照組比較，模型組小鼠血清LDL-C 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組小鼠血清LDL-C 水平降低（P＜0.05），見圖1D。2 組血清高密度脂蛋白（HDL）水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1E。

圖1 各組小鼠體質量、血脂變化

2.2 基因差異 共篩選出496 個表達上調的差異mRNA、1 595個表達下調的差異mRNA、892 個表達上調的差異lncRNA、502 個表達下調的差異lncRNA，見圖2。

圖2 基因熱圖

2.3 基因本體論 以P＜0.05 為篩選標準，生物進程中顯示出有375 個相關term，其中前4 個term 有RNA 剪接、核酸代謝過程、細胞大分子代謝過程、mRNA 代謝過程；細胞組分中顯示出有77 個相關term，其中前4 個有細胞內、膜界限的細胞器、細胞內部分、細胞內膜結合的細胞器；分子功能中顯示出有125 個相關term，其中前5 個有RNA結合、核酸結合、雜環化合物結合、有機環狀化合物結合、聚（A）RNA 結合。見圖3A。

以P＜0.05 為篩選標準，預測出22 個KEGG 信號通路，其中前20 個為泛素介導的蛋白水解、Hippo 信號通路、非小細胞肺癌、細胞周期、乙型肝炎、酮體的合成和降解、mTOR 信號通路、腎細胞癌、RIG-I 樣受體信號通路、膠質瘤、蛋白質在內質網中的加工、ErbB 信號通路、剪接體、p53 信號通路、泛酸和CoA 的生物合成、多巴胺能突觸、胰腺癌、鞘脂信號通路、mRNA 監控途徑、慢性粒細胞白血病。見圖3B。

2.4 共表達分析 共表達分析是以數學中相關性為基礎，從基因表達層面尋找表達譜相似的lncRNA-mRNA 關系對。大量功能相關的基因在相關的一組條件下有非常相似的表達譜，特別是被共同的轉錄因子共同調控的基因，或者產物構成同一個蛋白復合體，或者參與相同的調控路徑。因此，共表達分析及基于共表達結果的網絡構建可發現lncRNA 與mRNA 之間可能存在的作用關系，找到影響mRNA 表達調控的lncRNA，從而發現網絡中起中心調控作用的lncRNA 及發現lncRNA 可能存在的新作用機制。

使用cytoscape 軟件繪制網絡圖，發現gi ｜ 755474360、NONMMUT009611、NONMMUT024238、NONMMUT032729、NONMMUT039056、NONMMUT047338、NONMMUT050579、NONMMUT072360、ri ｜ 2310003C21、ri ｜ B130051E08 這10個lncRNA 與100 個mRNA 存在相互調控的共表達關系。見圖4。

2.5 靶基因預測 采用反式調控預測（trans 預測），通過blast 篩選出在序列上和目標lncRNA 互補的mRNA，再以RNAplex 計算2 條序列之間的互補能量，最終得到498 對可能與目標lncRNA 穩定結合的mRNA。再采用cytoscape 軟件進行篩選作圖，建立起334 個節點靶基因相互調控圖，其中Yod1、Zfp874b、Haus2、Strbp、Rbm34、Rmdn1、gi ｜755510242、NONMMUT024722、ri ｜ 6330564D18、ri ｜A630047B03、ri ｜ F830013G24、ri ｜ G370004A16 關系度均大于10。見圖5。

3 討論

高脂血癥又稱血脂異常，包括高膽固醇血癥、高甘油三脂血癥、低高密度脂蛋白血癥和混合型高脂血癥4 種類型［8］。高脂血癥可作為代謝綜合征的組分之一，與肥胖癥、2 型糖尿病、高血壓、冠心病、腦卒中等多種疾病密切相關［9］。

目前認為高脂血癥屬中醫學“膏脂”“脂濁”“痰濁”等范疇［10］。中醫認為高脂血癥屬于本虛標實，其主要病機是痰濁血瘀，致使肝脾腎虛，阻滯經脈，從而使膏脂布化失度［11］。降脂輕身方配伍嚴謹，全方體現了化痰除濕、瀉濁逐瘀之治法。但降脂輕身方作用的分子機制尚不明確，本研究從lncRNA 與mRNA 表達譜變化，來探討改善高脂血癥的分子機理。

通過對模型組與給藥組的ApoE-／-小鼠的肝臟組織差異基因篩選以及聚類，可以觀察到兩組數據組間序列差異明顯、組內序列具有相似性，分類明確，說明降脂輕身方對高脂血癥模型的調節作用顯著；Y 軸上相鄰的差異基因被聚為一類，其生物序列相近、功能以及生物特性具有相似性。聚類的結果可以為相關基因功能分析提供支持，從而為明確該藥物發揮調節高脂血癥的分子機制提供依據。

經GO 分析發現，給藥組與模型組的差異基因在細胞器中涉及到RNA 剪接、mRNA 代謝等核酸代謝以及細胞大分子代謝的過程中發揮RNA 結合、有機環狀化合物以及雜環化合物結合等分子功能；在KEGG 生物途徑富集分析中，RIG-I 樣受體、p53、ErbB、mTOR 和Hippo 信號通路被顯著性富集。有研究表明：抑制Hippo 信號通路可誘導肝臟細胞的分化、增殖、凋亡發生發展［12］，而Hippo 通路的末端效應器通過抑制YAP-SREBP 復合物的功能，對肝細胞脂肪生成產生負作用［13-14］。有文獻報道［15］，Hippo 信號途徑的功能障礙誘導肝細胞中單酰甘油脂肪酶（Monoacylglycerol lipase，MAGL）的過表達，MAGL 則是通過脂肪酸氧化參與脂質代謝的關鍵酶。這與我們的研究結果近似，在降脂輕身方的作用下，差異基因顯著富集出Hippo 信號通路，提示通過Hippo 信號通路可能是該方起到治療高脂血癥作用的靶點之一。

圖3 GO 分析

lncRNA-mRNA 共表達網絡是分析lncRNA 功能和調控機制的重要方式，提示我們聚為一類的基因通過共表達在基因轉錄中受到相似的調控。本研究中gi ｜755474360 等十個lncRNA 在降脂輕身方的作用下，通過共表達網絡調控著多個mRNA 的表達，從而發揮著不同的生物學功能。

lncRNA 通過調控靶基因mRNA 的轉錄、穩定性等多種方式影響其靶基因的表達［16］。本研究通過DAVID 數據庫對lncRNA 所對應的靶基進行功生物功能分析，得到以下結果：在細胞核以及胞質內ri ｜G370004A16 ｜ FL00003K09 ｜3994 參與轉錄調節、DNA 模板化生物進程，發揮金屬離子結合的功能；在細胞核中ri ｜6330564D18 ｜ PX00044K21 ｜1545 參與轉錄以及轉錄調節、DNA 模板化等生物進程，執行金屬離子結合與核酸結合功能；NONMMUT054817 在細胞核中參與轉錄調節、DNA 模板化生物進程；NONMMUT024722 在細胞核中參與轉錄以及轉錄調節、DNA 模板化、DNA 修復蛋白去泛素化以及運輸等生物進程，執行聚（A）RNA 結合、金屬離子結合、核酸結合、鋅離子結合、巰基依賴泛素水解酶活性、巰基依賴泛素特異性蛋白酶活性等分子功能。有研究報道［17］：大鼠肝臟中銅和鐵離子發揮抗氧化劑的作用抑制呼吸并增加自由基介導的線粒體磷脂過氧化；二氯化鈷誘發急性化學缺氧可加重非酒精脂肪肝小鼠的肝臟損傷；肝臟中內質網鈣離子代謝失衡使得產生內質網應激反應，可能是缺氧誘導脂類代謝障礙的調控途徑。提示我們在降脂輕身方的作用下，ri ｜G370004A16 等lncRNA 分別在細胞核與細胞質中通過參與金屬離子（例如鋅、鈣）結合、核酸結合等過程發揮對mRNA 轉錄及轉錄調控，從而調控著脂質代謝的生理作用。

圖4 共表達網絡圖

圖5 靶基因預測

綜上所述，通過對lncRNA 與mRNA 表達譜的分析發現，降脂輕身方對肝臟脂質代謝的調節作用明確。其分子機制可能通過Hippo 等信號通路的信號轉導以及lncRNAmRNA 分子網絡來發揮其調節脂代謝作用；gi ｜755474360等共表達網絡中的lncRNA 可能發揮了調控mRNA 的作用從而調節肝臟脂質代謝；NONMMUT024722 等靶基因可能通過參與金屬離子結合、核酸結合等方式來發揮對mRNA 轉錄及轉錄調控從而參與肝臟脂質代謝。