竹節參水提物對宮頸癌Hela 細胞凋亡的影響

劉 瀅，黃 宙

（1.湘潭醫衛職業技術學院，湖南湘潭 411102；2.湘潭市中心醫院，湖南湘潭 411100）

竹節參為五加科植物，性溫、味甘、味苦，具有滋補強壯、散瘀止痛及止血祛痰功效［1-4］，廣泛用于產后虛弱、咳嗽痰多及跌打損傷患者中［5］。現代藥理結果表明［6］，竹節參具有抗炎、延緩衰老、降血糖及抗腫瘤作用。皂苷是竹節參的主要活性成分（約占23.6%），且三萜類皂苷具有較高含量，具有解熱、抗菌、抗癌等生物作用。國內學者研究表明［7］，天然藥物具有較低的毒副作用，臨床使用時不宜產生耐藥性，且對實體瘤具有良好的療效，但是在宮頸癌中的作用機制研究相對較少。因此，本研究以宮頸癌Hela 細胞作為對象，探討竹節參水提物在宮頸癌Hela細胞中的作用機制及對細胞凋亡的影響，以期為宮頸癌治療提供新思路。

1 材料

1.1 細胞 宮頸癌Hela 細胞購于中國科學院細胞庫，將其接種在含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培養基中，在含5%CO2的37 ℃培養箱中培養，待細胞融合80%后進行傳代培養，取第3 代對數生長者，備用。

1.2 藥材 竹節參產地湖北恩施，購于恩施竹節參種植基地，經專家鑒定為正品。將藥材根莖干燥粉碎后純凈水回流提取3 次，濾液濃縮，即得提取物，提取率為25.8%，加入 DMEM 培養基依次制成 0（陰性對照）、50、100、150 μg／mL。

1.3 儀器 見表1。

表1 儀器信息

2 方法

2.1 細胞處理 取第3 代培養的宮頸癌Hela 細胞，0.25%EDTA 進行消化，調整細胞濃度為1×105／mL，接種在96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中至單層細胞。將0（陰性對照）、50、100、150 μg／mL 竹節參提取物分別加入宮頸癌Hela 細胞中（100 μL／孔），每種質量濃度設置5 個復孔，將培養板放置在37 ℃、5%CO2培養箱中，連續進行48 h 培養［8］。

2.2 細胞凋亡測定 采用一步法TUNEL 染色測定。取各組處理后的細胞，加入0.25% EDTA-胰蛋白酶完成細胞消化，調整細胞密度為2×105／mL，接種在96 孔板中，每孔200 μL，放入培養箱中48 h。在12、24、36、48 h 后向細胞中滴加TUNEL 檢測液（含TdT 酶2 μL、熒光標記液48 μL），避光孵育，熒光顯微鏡下觀察細胞情況，并且在波長480 nm、發射光540 nm 處測定OD值，每張圖片取5 個視野，在400 倍下完成凋亡細胞核計數，獲得凋亡率［9］。

2.3 細胞周期測定 采用流式細胞計數儀測定。取生長良好的宮頸癌Hela 細胞，調整細胞濃度為1×105／mL，接種在6 孔培養板中，連續培養24 h 后換入新鮮培養基，連續培養48 h 后加入不含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶消化懸浮，4 ℃下收集細胞。采用預冷的PBS 緩沖液（pH 值為7.4）對細胞沖洗2 次，加入-20 ℃預冷的乙醇3 mL，吹打均勻后放置在-20 ℃冰箱中固定24 h。測定前對各組細胞離心10 min（1 424×g），PBS 緩沖液沖洗2次，去除上層清液后重懸于200 μL 0.1 mmol／L EDTA 溶液中，30 min 避光孵育后加入35 μL 2% Tritonx-100、114 μL 150 μg／mL PI 溶液，充分混合后避光反應10 min，將最終獲得的混合液于EPICS XL 型流式細胞儀中完成細胞周期測定［10］。

2.4 細胞形態觀察 采用Hoechst 33342 熒光染色觀察。取不同質量濃度竹節參水提物處理后的細胞，離心10 min后去除上層清液，加入10 g／L Hoechst 33342 熒光染色液，避光染色10 min 后去除染液，PBS 洗滌2 次后涂片，晾干后在熒光顯微鏡下觀察，波長為340 nm，保存結果［11］。

2.5 凋亡相關基因測定

2.5.1 RNA 提取 向各組處理后的細胞中加入500 μL trizol，混合、均勻后加入氯仿0.2 mL，劇烈振蕩15 s，常溫下靜置2～3 min 后離心15 min（12 000 r／min），獲得3層液體（上層為水相，中間層與下層為有機相）。取RNA沉淀，轉移到新的EP 管中，加入0.5 mL 異丙醇，混合后放在-20 ℃冰箱中，10 min 離心（1 194×g），獲得凝膠狀沉淀（即為RNA）。充分洗滌RNA，加入250 μL DEPC、750 μL 乙醇，乙醇沖洗沉淀，離心5 min（2 315×g），取沉淀放入工作臺上干燥20 min。利用紫外分光度儀檢測RNA 濃度，并完成RNA 提純（以核糖核酸酶作為空白對照），在260 nm 波長處測定吸光度。采用脫氧核糖核酸酶處理RNA 后，放入冰箱中［12］。

2.5.2 PCR 檢測 采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）法測定P53、Bax、Casepase-3 mRNA 表達水平，引物序列見表2。設定PCR 反應條件為30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min，連續進行35個循環，最后在72 ℃下完成10 min 延長。擴增產物放入1.5%瓊脂凝膠中電泳，完畢后采用UVP 凝膠圖像完成灰度值的測定，以β-actin為內參［13］。

表2 引物序列

2.6 統計學分析 通過SPSS18.0 軟件進行處理，計數資料以百分率表示，組間比較采用卡方檢驗；計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞增殖的抑制作用 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈濃度、時間依賴性，36 h 后可達50.0%以上，見表3。

3.2 竹節參水提取物對宮頸癌HeLa 細胞周期的影響 竹節參水提取物主要作用于宮頸癌Hela 細胞G0／G1期與S期，隨著其劑量升高逐漸集中于G0／G1期，見表4。

3.3 竹節參水提取物對宮頸癌HeLa 細胞形態的影響 Hoechst 33342 熒光染色顯示，0 μg／mL 竹節參水提物下Hela細胞形態均一，結構相對完整；在50、100、150 μg／mL下，Hela 細胞開始出現凋亡，細胞形態固縮，可見凋亡小體，并且劑量越高，細胞凋亡越明顯，見圖1。

表3 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞增殖的抑制作用（%，， n＝4）

表3 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞增殖的抑制作用（%，， n＝4）

注：與0 μg／mL 比較，?P＜0. 05；與12 h 比較，#P＜0.05。

表4 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞周期的影響（%，， n＝4）

表4 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞周期的影響（%，， n＝4）

注：與0 μg／mL 比較，?P＜0.05。

圖1 不同劑量竹節參水提取物下宮頸癌Hela 細胞形態

3.4 竹節參水提取物對宮頸癌HeLa 細胞凋亡基因表達的影響 竹節參水提取物可增加宮頸癌Hela 細胞中P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達，并呈濃度依賴性，見表5、圖2。

表5 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞凋亡基因表達的影響（， n＝4）

表5 竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞凋亡基因表達的影響（， n＝4）

注：與0 μg／mL 比較，?P＜0.05。

4 討論

圖2 不同劑量竹節參水提取物下宮頸癌HeLa細胞凋亡基因表達

宮頸癌是女性發生率較高的惡性腫瘤，具有發病率高、治愈率低、致死率高等特點［14］。目前，化療、手術與放療占據宮頸癌治療的主要地位，但是無論何種方法均存在明顯的局限性，且治療均無法做到徹底、副作用較大，患者治療后復發率較高，導致患者遠期生存率較低［15］。竹節參是臨床上常用的中藥，具有滋補強壯、散瘀止痛、止血祛痰等作用［16］。體外及動物實驗結果表明［17］，竹節參水提物對于肝癌、鼻咽癌、肺癌及胃癌等實體瘤具有良好的抗腫瘤作用，能抑制腫瘤細胞的增殖與生長，誘導腫瘤細胞凋亡。同時，竹節參水提物能抑制血管的形成，有助于增強機體免疫功能。有研究表明［18］：竹節參具有抗炎及潛在的抗腫瘤作用，其水提物能顯著增強機體免疫水平，能抑制腫瘤細胞的生長。因此，本研究基于當前研究，分析了竹節參水提物對于宮頸癌HeLa 細胞的作用機制，結果表明：竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，能促進細胞凋亡，且細胞的凋亡率隨著竹節參水提取物濃度、作用時間的延長增加，36 h時竹節參水提取物對宮頸癌Hela 細胞增殖抑制基本達到50.0%以上；竹節參水提取物作用于宮頸癌Hela 細胞G0／G1期與S 期；隨著竹節參水提取物濃度升高，竹節參水提取物對于宮頸癌Hela 細胞作用集中于G0／G1期，說明竹節參水提物能抑制宮頸癌HeLa 細胞的增殖、生長，能促進細胞凋亡，藥物多作用于細胞生長初期，且藥物濃度越高，作用效果越明顯。

細胞凋亡指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主、有序的死亡。細胞凋亡有別于細胞壞死，其過程不是被動的過程，而是主動的過程，多涉及基因的激活、表達與調控作用，是為了更好的適應生存而主動爭取的一種死亡過程［19］。但是，對于腫瘤細胞而言其生長無限增殖，導致細胞凋亡紊亂，會對宿主產生明顯的不適，嚴重者可危及生命。P53 基因屬于人體抑癌基因，含有大量的脯氨酸，其失活對腫瘤的形成具有重要的意義。臨床研究表明［20］，P53 基因是相對重要的抗癌基因，其野生型能誘導細胞凋亡，防止癌變的發生，亦可輔助細胞基因修復。但是，P53基因發生突變后，則會增加癌變發生率。Bax 基因屬于兔抗人單克隆抗體，屬于Bcl-2 基因家族中細胞凋亡的促進基因，其過度表達能拮抗Bcl-2 的保護效應，能使得細胞趨于死亡。研究表明：Bax 基因是人體主要凋亡基因，可與Bcl-2 形成異二聚體，能抑制Bcl-2 的產生，是人體相對重要的促細胞凋亡基因之一。Caspase-3 在細胞凋亡中具有不可替代的作用，可以被多種因素活化，在CTL 細胞殺死中發揮重要作用。臨床研究表明：Caspase-3 與DNA 修復、基因完整性監護等有關。本研究中，Hoechst 33342 熒光染色結果表明：竹節參水提物0 μg／mL 時HeLa 細胞形態均一且結構相對完整；而竹節參水提取物 50、100、150 μg／mL下HeLa 細胞開始出現凋亡，細胞形態固縮，可見凋亡小體；竹節參水提取物能增加宮頸癌HeLa 細胞中凋亡相關基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達，且竹節參水提取物濃度越高，凋亡相關基因P53、Bax、Caspase-3 mRNA 表達越高，說明竹節參水提物能誘導細胞凋亡，能增加凋亡基因表達水平，進一步促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，竹節參水提物體外能抑制宮頸癌HeLa 細胞增殖，能誘導癌細胞的自噬與凋亡，可能與調控凋亡相關基因mRNA 表達有關，具有潛在的抗癌作用。