基于網絡藥理學研究升陷湯治療心力衰竭的作用機制

王明珠，符德玉，姚 磊，桂明泰，盧 波，李建華

（1.上海中醫藥大學，上海 201203；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院心血管研究室、 心內科，上海 200437）

心力衰竭是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的復雜臨床綜合征，為各種心臟疾病的嚴重表現或晚期階段［1］，主要表現為呼吸困難、疲乏、液體潴留，包括肺瘀血、體循環瘀血、外周水腫等［2］，在發達國家其死亡率為1.5%～2.0%，70 歲以上的人群患病率≥10%［3］，而在我國住院患者病死率約為4.1%［4］。原發性心肌損害和異常是心力衰竭最主要的病因，并且除了心血管疾病外，非心血管疾病也可導致其發生，目前它是一種慢性、自發進展性疾?。?］。2018 年中國心力衰竭診斷和治療指南提出，神經內分泌系統激活導致心肌重構是引起心力衰竭發生發展的關鍵因素，推薦盡早使用沙庫巴曲纈沙坦類藥物，以進一步減少其發病率及死亡率［6］。

中醫認為，心氣是心臟功能活動的原動力，“心氣不足”是心力衰竭發生的病理基礎及其轉歸預后的決定因素［7］。心力衰竭總屬本虛標實之證，以心氣不足、心陽虛衰為本，血脈瘀滯、水飲內停、痰濁不化為標，益氣、活血、利水為治療大法［8］。

升陷湯出自《醫學衷中參西錄》，主治胸中大氣下陷，方劑藥味簡單，量大功專［9］。方中重用黃芪六錢甚達數兩，以其補氣升陽重用為君藥；柴胡、升麻共用以升陽舉陷，前者引下陷之大氣自左而升，后者引下陷之大氣自右而升，同為臣藥；知母清熱涼潤，可緩黃芪之溫燥，為佐藥；桔梗為舟楫，載諸藥上達于胸中，為使藥，諸藥配伍，共奏補氣、升陽、舉陷之功效［10］，主治“胸中大氣下陷，氣短不足以息，或努力呼吸，有似乎喘；或氣息將停，危在頃刻。其兼證，或寒熱往來，或咽干作渴，或胸悶怔忡，或神昏健忘”［11］。張錫純提出“大氣下陷”理論，即胸中氣陷、行血乏力，與現代醫學對血液循環心臟泵血功能衰竭的認識一致，可認為是中醫“心衰病”之主要病機之一［12］，他所創的升陷湯、回陽升陷湯等方劑了可靈活運用于心力衰竭的治療，隨證加減，往往取得較好的臨床療效［13］。

中藥及其復方具有多成分、低選擇性、多靶點相互作用的特點，這種復雜性使其質量難以控制，缺乏合理有效的安全評價體系，對其作用、配伍機制的分析也相對困難［14-15］。近年來網絡藥理學在國際上興起，它具有多方向交叉融合的特點，可實現對中藥及其復方的綜合網絡分析，從系統層次了解疾病的發生機制，其研究策略的整體性、系統性與中醫整體觀念、辨證論治不謀而合，在識別中藥及其復方活性成分及作用靶點、闡明作用機制、解釋組方規律具有重要的優勢及潛力［16-17］。因此，本研究采用網絡藥理學分析升陷湯治療心力衰竭的藥效物質基礎和分子機制，建立“藥效成分-靶標-通路”關系網絡，探究該方多成分、多靶點、多途徑作用機制，為其基礎實驗研究和臨床合理應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 成分虛擬篩選 本研究通過中藥系統藥理數據（TCMSP，http：／ ／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／Tcmsp.Php）、臺灣中醫藥資料庫（TCM Database，http：／ ／tcm.cmu.edu.tw／zh-tw）檢索升陷湯所有化學成分，將其進行篩選，化合物口服生物利用度（OB）篩選閾值均≥30%，化合物類藥性（DL）篩選閾值均≥0.18。

1.2 候選化合物靶點預測 通過中藥系統藥理數據庫（TCMSP，http：／ ／ibts.hkbu.edu.hk／LSP／tcmsp.php）檢索候選化合物靶點，并通過Uniprot 數據庫（http：／ ／www.uniprot.org／）將預測出的靶點蛋白名轉換為基因名。

1.3 化合物-靶點網絡和靶點-疾病網絡的構建 通過Genecards 數據庫（https：／ ／www.genecards.org／）與OMIM數據庫（https：／ ／www.genecards.org／）檢索與心力衰竭相關的基因，通過R 軟件將化合物、心力衰竭靶點進行統計分析，獲得藥物-靶點網絡，并且繪制藥物靶點韋恩圖，存在交集的蛋白質即有可能是升陷湯活性成分治療心力衰竭的靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建 將藥物靶點和疾病靶點基因，從STRING 數據庫（http：／ ／stringdb.org）中繪制PPI 網絡，獲得蛋白互作CSV 文件，通過R 軟件進行基因關聯度分析，并獲得關聯度排名前30 的基因。再采用Cytoscape3.7.1 軟件，將靶點基因、藥物組成進行網絡拓撲分析，進一步篩選升陷湯干預心力衰竭的潛在藥物、基因靶點。

1.5 基因富集分析 通過R 軟件ClusterProfile 程序包（http：／ ／bioconductor.org／biocLite.R）對篩選出的基因進行GO 功能、KEGG 通路富集分析，獲得柱狀圖、富集圖相關通路圖，以進一步闡明升陷湯的潛在靶點在基因功能和信號通路中的作用。

2 結果

2.1 升陷湯活性成分篩選 共檢索出806 種成分，其中柴胡349 種，黃芪87 種，桔梗102 種，升麻187 種，知母81種。以OB≥30%、DL≥0.18 為標準，共篩選出76 種作為候選化合物。具體見表1。

表1 升陷湯中生物利用度較高的化合物

2.2 藥物靶點與疾病靶點的交集預測 將藥物靶點與心力衰竭疾病基因靶點通過R 語言進行統計分析，獲得升陷湯藥物成分-心力衰竭靶點基因交集，并繪制藥物靶點韋恩圖，見圖1。共獲得藥物-疾病交集基因197 個，可認為是升陷湯干預心力衰竭的潛在基因靶點，具體見表2。

2.3 蛋白靶點PPI 網絡構建 通過STRING 蛋白數據庫獲取靶點蛋白的相互作用，并根據其基因相互結合度進行數據顯示統計，結果見圖2。再篩選出蛋白相互作用度＞60 的基因，繪制柱狀圖，發現排名前20 的作用靶點為AKT1、IL6、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK1、EGFR、MAPK8、MYC、PTGS2、EGF、CXCL8、MMP9、FOS、ESR1、IL1B、CCND1、CAT、CCL2、ERBB2，它們是升陷湯干預心力衰竭可能性最大的基因靶點，具體見圖3。

圖1 藥物靶點與疾病靶點的韋恩圖

表2 升陷湯與心衰靶點疾病交集基因

進一步縮小范圍，將基因關聯度排名最靠前的AKT1、IL6、VEGFA 基因單獨繪制蛋白靶點，以更加明確地展示其相互作用機制，并更直觀地展示升陷湯干預心力衰竭最有可能的潛在靶點，具體見圖4。

2.4 基因-化合物-疾病靶點互作圖 采用Cytoscape3.7.1軟件，將升陷湯組成成分、交集靶點基因進行網絡拓撲分析，繪制可視化的相互作用圖，結果見圖3。升陷湯中發揮主要作用的成分有32 種，其中黃芪11 種，升麻8 種，知母5 種，柴胡4 種，桔梗4 種，主要包括黃芪異黃烷苷、黃芪糖苷類、知母皂苷類、升麻萜類、桔梗苷甲酯等化合物，具體見圖5。再提取排名最靠前的3 個基因靶點AKT1、IL-6、VEGFA，構建互作圖，篩選出5 種成分，分別為薯蕷皂苷、莰非醇、木犀草素、芍藥苷、槲皮素，對其作進一步分析，結果見圖6。

圖2 藥物-疾病靶點蛋白作用網絡

圖3 藥物靶點與疾病靶點的交集基因柱狀圖

圖4 排名前3 名基因的相互作用圖

2.5 GO 富集分析 通過R 語言軟件中的ClusterProfiler GO 對升陷湯成分-靶點-疾病網絡所涉及的197 個蛋白質功能進行富集分析，確定了182 個GO 條目（P＜0.05），并對其進行分析，列出前20 條主要生物過程，進行柱狀圖統計，主要包括轉錄因子活性、輔因子結合、細胞因子受體結合、受體配體活性、酰胺結合、蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、細胞因子活性等，具體見圖7。

圖5 升陷湯藥物組成-心力衰竭靶點相互作用網絡

圖6 AKT1、IL-6、VEGFA 基因-化合物-疾病互作圖

圖7 GO 條目柱狀圖

另外，主要涉及“細胞組成”的有轉錄因子激活、細胞因子受體結合、酰胺及多肽結合、G 蛋白偶聯胺受體活性、類固醇激素受體活性等；預測靶點在“生物過程”中，主要富集于調節細胞增殖和凋亡、RNA 信號轉錄、信號傳導、炎癥反應等；在“分子功能”中，主要富集于蛋白結合、酶結合、蛋白酶活性及細胞因子活性等方面，其GO 條目富集圖見圖8。

2.6 KEGG 通路富集分析 通過R 語言軟件中的Cluster-Profiler KEGG 對篩選出的基因進行KEGG 通路富集分析，建立靶點-通路網絡圖，197 個靶點可富集到160 條信號通路中（P＜0.05），前20 條主要通路見圖7。再對其進行富集分析，排除與腫瘤、抗病毒等無關的通路，發現富集度最高的為PI3K-Akt 信號通路，同時還涉及到TNF、、IL-17信號通路等，具體見圖9～10。

圖8 GO 分析條目富集圖

圖9 KEGG 條目柱狀圖

圖10 KEGG 通路富集圖

2.7 通路圖標注 根據KEGG 富集分析所得到的通路ID 信息，從通路數據庫中獲取具體通路圖，將富集度最高的PI3K-Akt 信號通路進行富集分析，發現基因關聯度最高的基因為AKT1，起到中樞調節作用，意義最大，具體見圖11。

3 討論

心力衰竭的發生與離子缺陷、炎癥和重構、心肌肥厚等密切相關，新型生物標志物的發現有利于其早期診斷。中醫藥在心力衰竭診斷治療過程中的優勢和特色明顯，積累了豐富的臨床經驗，中西醫結合有利于患者得到全方位綜合性治療。升陷湯作為臨床上常用的治療心力衰竭的經典中醫方劑，對其藥理機制的研究顯得尤為迫切。

圖11 升陷湯調節PI3K-Akt 通路的具體因子

本研究采用網絡藥理學方法構建了升陷湯“成分-疾病-靶點”交互網絡圖，篩選出76 種潛在藥物成分和197個共同作用蛋白靶點。其中，藥物成分主要有黃芪總皂苷、柴胡皂苷、升麻苷、知母皂苷等，與心力衰竭關系密切，例如黃芪總皂苷干預阿奇霉素誘導的心力衰竭大鼠模型中可明顯升高EF，降低FS、LVIDs、LVIDd 明顯縮小，并且收縮時左室間隔厚度增加，左室重量指數減少，從而改善心力衰竭大鼠心功能，延緩左室重構［18］；黃芪多糖可能通過激活慢性心衰大鼠AMPK 相關通路來促進心肌攝取利用FFA，從而改善慢性心衰［19］；柴胡皂苷可使離體蛙心心肌收縮力先增強后減弱，其作用機制可能與激動心肌細胞上的β 受體進而激活L 型鈣通道有關，從而改善心功能［20］；升麻苷在體外培養的乳鼠心臟微血管內皮細胞中金額明顯抑制血管內皮細胞分泌炎性細胞因子，從而起到保護心臟微血管的作用［21］。

在升陷湯干預心力衰竭的核心基因靶點篩選和信號通路富集分析中發現，基因關聯度最高的為Akt1，信號通路富集度最高的是PI3K／Akt。絲氨酸／蘇氨酸激酶Akt 在哺乳動物中Akt 有3 種亞型，即Akt1、Akt2、Akt3［22］，其中Akt1 主要參與細胞凋亡的途徑，來調節細胞的存活與否；Akt2、Akt3 分別多表達于胰島組織、腦組織［23］，它是PI3K／Akt 信號通路的中心，為PI3K 信號轉導通路中重要的下游靶點［24］。PI3K／Akt 信號通路是參與細胞增殖調控的重要通路之一，既有抗凋亡作用，又有促凋亡作用，以前者為主，它是調節細胞周期的重要通路，與其生長、增殖密切相關，在維持細胞生存中發揮重要作用［25］。

心功能障礙、惡化是多種心血管疾病的最終歸宿，尤其是心力衰竭，可加速心室重構、心肌細胞凋亡、心肌纖維化等最終導致心臟結構、功能發生改變，最終導致心功能急劇惡化［26］。PI3K／Akt 是調節心臟功能的一條重要的信號轉導通路，是心臟調制的壓力閥，適度激活可抑制心肌細胞凋亡，抑制心室重構、調節能量代謝，但過度激活反而會導致心功能障礙［27-28］。Sun 等［29］發現，在心衰大鼠中激活PI3K／Akt 信號通路可減輕心功能障礙，抑制心臟纖維化，并且其心肌肥厚也得以控制。心肌纖維化在心力衰竭的病因學中起著重要的作用，有研究表明PI3K／AktmTOR 信號通路可調節心肌成纖維細胞的增殖和遷移，可能與心力衰竭的心肌纖維化和功能障礙相關［30］；Li 等［31］報道，在異丙腎上腺素誘導的心力衰竭大鼠模型中，PI3K／Akt 信號通路可激活對心臟組織炎癥、氧化應激、凋亡的抑制作用；心臟的能量代謝在維持心臟功能方面發揮關鍵作用，新近研究發現，PI3K／Akt 信號通路可平衡心臟能量代謝，能促使葡萄糖、蛋白質、脂質等特定基因表達增加，進一步調節心肌細胞中葡萄糖、脂類的能量代謝途徑，從而更好地發揮為心肌細胞供能的作用，有效延緩心臟功能障礙的速度［32-33］。

綜上所述，本研究所發現的升陷湯相關通路及靶點可為該方今后的深入探討奠定理論基礎。但本研究僅從網絡藥理學角度推測了升陷湯主要活性成分及其可能作用機制，后期仍需進行實驗驗證，尤其是新發現的抗腫瘤、抗病毒、調節糖尿病相關通路。