基于網絡藥理學探討生脈散治療動脈粥樣硬化的作用機制

歐陽效強，饒 煉，雷 敏，陳曉坤，洪創雄

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是危害我國全民健康的首要疾病，據推算，目前我國CVD 人數約2.9 億，CVD 所導致死亡人數占全民疾病死亡人數的40%以上，比腫瘤還高，而且CVD 患病率及死亡率仍然在不斷增加［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是眾多心腦血管疾病形成的主要病理基礎之一，因此，有效防治AS 對于預防心腦血管疾病發生發展至關重要。目前，西醫降脂、抗血小板聚集等藥物雖然能夠有效的延緩AS 的發生和發展，但是也存在諸多問題，如調脂藥物易導致肝腎功能損害及橫紋肌溶解［2］，抗血小板藥物容易引起胃腸道不適和出血等［3］。而中醫藥在治療動脈粥樣硬化方面有獨特的優勢，中醫藥能夠從整體上調節臟腑功能，延緩疾病進展，改善患者的臨床癥狀，而且毒副作用小［4］。因此，中醫藥為動脈粥樣硬化的防治提供了一個很好的方向。

中醫學沒有“AS”的病名，但從病因病理、臨床癥狀以及發病部位的不同，臨床上常常將冠狀動脈粥樣硬化，頸動脈硬化，腦動脈硬化歸屬于“脈痹”“胸痹心痛”“眩暈”“中風”等范疇。目前多數醫家認為AS 的基本病機為“本虛標實”，氣陰兩虛為本，痰、瘀、毒為標，治療上益氣養陰治其本，活血、化痰、解毒治其標［5］，臨床有較多醫家常以生脈散加減治療。國醫大師鄧鐵濤教授和陳可冀院士在治療氣陰兩虛型冠心病時，常用生脈散加減［6-7］。洪創雄教授多年致力于心血管疾病研究，常以生脈散加減治療冠心病，臨床療效確切，值得推廣。

生脈散出自《醫學啟源》，由三味藥組成（人參、麥冬、五味子）。方中人參甘溫補氣生津為君；麥冬甘而微寒，養陰生津為臣，五味子味酸而咸，擅長固津攝氣為佐，三藥合用，一補一潤一斂，益氣養陰生津，是治療氣陰兩虛的經典名方。現代藥理研究表明，生脈散具有調節血脂、減輕炎癥反應、抗氧化［8］等作用，這為生脈散防治AS 提供了一定的科學依據。同時臨床也有較多文獻報道生脈散能夠用于治療AS，但大多是從單一個角度去解釋其可能作用機制，缺乏系統性研究。而中藥成分的復雜性及作用的整體性提示我們，生脈散可能通過多成分、多靶點、整體調節來發揮作用，因此需要我們進行深入系統的研究和探討。

本研究通過網絡藥理學方法，構建生脈散-AS-靶點相互關系網絡，研究生脈散中多種成分、多個靶點與AS 的相互作用關系，從整體上系統的探討生脈散治療AS 的作用機制，并為后續深入開展實驗研究和臨床應用提供指導。

1 方法

1.1 生脈散活性成分與潛在靶點篩選 首先在中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）分別輸入“人參、麥冬、五味子”3 味中藥藥名，查找三者全部化學成分，篩選條件是化合物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，然后查找化合物對應的靶點。由于在TCMSP 數據庫中沒有“麥冬”的相關成分，故通過中醫分子機理生物學信息分析工具（BATMAN-TCM，http：／ ／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）進行檢索，篩選條件是Score cutoff ≥20、P-value cutoff＜0.05［9］。通過上述2 個數據庫檢索得到生脈散3 味中藥的化合物和靶點，將結果合并，建立生脈散化學成分—靶點數據庫。

1.2 AS 疾病靶點的確定 通過TTD 數據庫（http：／ ／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）、CTD 數據庫（http：／ ／ctdbase.org／）、OMIM 數據庫（https：／ ／www.omim.org／）、DisGenet 數據庫（http：／ ／disgenet.org／），搜集與AS 相關的靶點。

1.3 成分-靶點網絡構建 篩選生脈散活性成分潛在作用靶點及AS 疾病靶點，通過韋恩圖取交集得到兩者的共同靶點，并進行藥物成分靶點-AS 疾病靶點映射，利用Cytoscape3.6.1 軟件構建“藥物成分-作用靶點”互作網絡。藥物活性成分和作用靶點以“節點”表示，節點之間的相互作用以“邊”表示。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建 將生脈散和AS 共同作用靶點代入STRING（https：／ ／string-db.org／）數據庫中，以置信度分數score＞0.9 為條件進行篩選，其余參數不變。將得到的結果以文本形成導入Cytoscape3.6.1 軟件，構建PPI 相互作用網絡圖。

1.5 基因本體（GO）功能和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用David 數據庫（https：／ ／david.ncifcrf.GOv／）對生脈散和AS 共同作用靶點蛋白進行GO 功能和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能；KEGG 富集分析可以得到生脈散和AS 共同靶點所富集的信號通路。P＜0.05 表示差異具有統計學意義［10］。

2 結果

2.1 生脈散化合物 在2 個數據庫（TCMSP、BATMANTCM）進行檢索篩選后，得到人參、麥冬、五味子的有效化合物45 個，其中人參22 個，麥冬18 個，五味子8 個，其中3 個為共有成分，與此對應的化合物預測靶點有418 個。

2.2 AS 疾病靶點 在疾病靶點數據庫（TTD、CTD、OMIM 和DisGenet）查找檢索AS 的疾病作用靶點，共得到254 個。

2.3 治療AS 化合物及潛在靶點 利用韋恩圖獲得生脈散和AS 兩者的共同作用靶點46 個，分別對應23 個活性化合物（人參13 個，五味子5 個，麥冬7 個），見圖1，化合物見表1。由此可知，生脈散可以通過多種成分作用于AS疾病的多個相關靶點來發揮作用。

圖1 生脈散-動脈粥樣硬化共同基因靶點

表1 生脈散中23 個化合物

2.4 成分-靶點網絡及靶點互作分析 將生脈散活性成分和作用靶點信息導入Cytoscape3.6.1 軟件，構建生脈散治療AS 的“成分-靶點”網絡圖，共包含72 個節點（23 個成分節點，46 個基因節點，3 個藥物節點）、124 條邊，見圖2。在網絡中，一個節點的度（degree）表示網絡中和節點相連路線的條數，度值越大則表明該化合物發揮作用的可能性越大，故圖1 中度值大于等于5（中位數）的化合物有8 個，分別為羥基苯甲酸（degree ＝23）、山柰酚（degree＝17）、豆甾醇（degree＝12）、麥冬黃烷酮E（degree ＝6）、甲基麥冬黃烷酮B（degree ＝6）、人參皂苷rh2（degree ＝5）、灌木遠志酮 A（degree ＝5）、β-谷甾醇（degree＝5），可能是生脈散抗AS 的重要成分。

圖2 生脈散化合物-疾病靶點互作網絡

2.5 蛋白相互作用（PPI）網絡 將46 個共同靶點導入STRING 中，構建生脈散治療AS 潛在靶點PPI 網絡，將結果以文本形式導出，然后導入Cytoscape3.6.1 軟件中，利用network analyzer 插件進行網絡拓撲分析，得到潛在靶點基因拓撲參數自由度（degree）、介度中心度（betweenness）和接近中心度（closeness），自由度表示節點所包含的邊的數目，靶點自由度越大，表明通過該靶點發揮作用的可能性越大。結果，自由度≥15（中位數）的靶點有22 個，具體見表2，相互作用關系見圖3。

2.6 GO 功能富集分析 在DAVID 數據庫中對生脈散和AS 的共同靶點進行GO 功能富集分析，根據P＜0.05 確定了101 個GO 條目，其中與生物過程（BP）相關的條目73個；與細胞組成（CC）相關的條目7 個，主要涉及細胞外空間、核、質膜外側、高爾基體、細胞外基質等方面；與分子功能（MF）相關的條目21 個，主要涉及脂質代謝、炎癥反應、信號傳導、調節胰島素分泌、血管收縮調節、平滑肌細胞增殖、雌激素、內皮細胞等方面，推測生脈散可能通過調節這些生物過程來起到治療AS 的作用，具體見表3。

表2 22 個核心靶點

圖3 生脈散核心靶點PPI 網絡

2.7 KEGG 通路富集分析 通過DAVID 對46 個靶點進行KEGG 通路分析，得到35 條生物學通路，根據P＜0.05 并結合相關文獻進行篩選，得到AS 相關通路22 條，具體見表4。

3 討論

本研究系統分析了生脈散（麥冬、人參、五味子）的有效成分，預測了治療AS 的相關靶點，構建了生脈散-AS-靶點網絡。通過對生脈散-靶點網絡分析得出生脈散治療AS 的主要成分是山柰酚、豆甾醇、麥冬黃烷酮E、甲基麥冬黃烷酮B、人參皂苷rh2、β-谷甾醇等。山柰酚是人參的重要成分，是一種有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成和血小板活性等作用的黃酮類化合物［11］；有研究報道山柰酚具有很好的抗炎特性，能夠抑制促炎因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）釋放，增加抑炎因子白介素10（IL-10）的表達和分泌［12-13］；山柰酚不僅可以保護低密度脂蛋白免受氧化，還可以通過抑制巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取來預防AS［14］。此外，山柰酚還能抑制凝血酶和FXa 的酶活性，起到抑制血栓形成和血小板活化的作用［15］，而血小板聚集和血栓形成是AS 的發病機制之一，因此有一定的治療AS 的作用。豆甾醇為人參和麥冬共有成分，它具有抑制血管緊張II 刺激的A7r5 大鼠大動脈血管平滑肌細胞增殖，具有一定的抗AS 的作用［16］。甲基麥冬黃烷酮B 是麥冬的有效成分，能夠顯著下調促炎因子白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素8（IL-8）的表達，起到抗慢性炎癥作用［17］。

表3 生脈散-AS-基因的生物學過程

通過對生脈散核心靶點PPI 網絡進行拓撲分析，共分析22 個關鍵靶點，這些靶點涉及脂質代謝、炎癥反應、胰島素分泌、細胞因子、細胞增殖與遷移等生物學過程。通過GO 功能富集分析也提示生脈散治療AS 涉及上述生物學過程。此外，KEGG 通路富集分析結果顯示生脈散可能通過PPAR 信號通路、胰島素抵抗、TNF 信號通路、核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路起到治療AS 的作用。

表4 生脈散-AS-基因通路富集分析（P 值排名前十）

目前認為，炎癥反應在AS 病理過程中起著基礎性作用［18］。TNF 信號通路、NF-κB 信號通路的激活對促進AS發生發展起著至關重要的作用。TNF-α 是血管內皮細胞損傷或導致血管功能紊亂的重要炎癥因子，它可使血管損傷和血栓形成，并能夠激活誘導NF-κB 入核，激活NF-κB 信號通路，促進TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子的釋放，從而引起和加重機體炎癥反應［19］。有研究顯示，生脈散可以降低中暑大鼠血清白介素1β（IL-1β）、IL-6、TNF-α 的水平，預防中暑引起的低血壓和腦缺血損害［20］。邢清敏、陸曙等在利用生脈散干預擴張型心肌病大鼠模型的研究中發現，生脈散可通過下調Toll 樣受體4（TLR-4）和NF-κB 的基因、蛋白表達，從而抑制TLR-4 ／NF-κB 信號通路，降低炎癥因子IL-6、TNF-α 的水平［21］。本研究通過分析，發現TNF 是生脈散和AS 的核心靶點，結合既往研究，生脈散可能通過調控TNF-α 和TNF 信號通路、NF-κB 信號通抑制炎癥反應。

胰島素抵抗和AS 的形成密切相關，機體在發生胰島素抵抗時，胰島素信號通路受損引起血管內皮功能紊亂和血管平滑肌細胞增殖和遷移、誘導細胞凋亡［22-23］。而血管內皮功能受損和血管平滑肌細胞遷移增殖是AS 的早期病理表現。吳小慧等實驗研究顯示生脈散能夠降低2 型糖尿病大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP 等的水平，改善胰島素抵抗，并能夠降低血清血管內皮生長因子（VEGF）水平，起到抗AS 作用［24-25］。結合網絡藥理學研究，生脈散和AS共同靶點涉及胰島素抵抗、1 型糖尿病、2 型糖尿病。由此，我們可以推測，生脈散可以通過改善胰島素抵或通過治療糖尿病發揮防治AS 的作用。

氧化應激損傷也是AS 發病機制之一，氧化應激能升高氧化低密度脂蛋白水平，促進泡沫細胞形成，損害血管內皮細胞，促進炎癥反應和細胞增殖、凋亡，從多個方面參與AS 的發生發展［26］。前期已有研究表明，生脈散提取物能夠通過清除過氧化氫（H2O2）、活性氧（ROS）發揮抗氧化應激的作用［27-28］。在慢性間歇性缺氧小鼠模型的實驗中也證實了生脈散能降低丙二醛（MDA），增加超氧化物歧化酶（SOD）水平，顯示出良好的抗氧化活性［29-30］。也有研究顯示，加味生脈散能夠延緩家兔AS 斑塊的形成，并能夠降低甘油三酯（TG）的水平，提示加味生脈散具有調節血脂的作用［31］。

過氧化物酶增殖物激活受體（peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR）主要有 PPAR-α、PPAR-β 和PPAR-γ 三種表型，其中PPAR-α、PPAR-γ 與AS 密切相關。研究表明，PPAR-α 和PPAR-γ 的激活能通過抑制血管內皮炎癥反應，抑制細胞增殖和遷移，抑制單核細胞轉化成泡沫細胞，減少血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達等多個方面，發揮抗AS 的作用［32］。此外激活的PPAR-α 在調節脂肪代謝，尤其是降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的濃度發揮著重要作用［33］。本研究發現，PPAR-α 和PPAR-γ 是生脈散和動脈粥樣硬化的共同作用靶點。因此我們推測，生脈散有可能通過調節PPAR 信號通路調節脂質代謝，降低血脂水平，抑制炎癥反應、細胞增殖和遷移、單核細胞轉化等防治AS。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學研究方法，構建了生脈散-AS-靶點互作網絡，通過分析得出，生脈散能夠通過作用于胰島素、腫瘤壞死因子等多個靶點，調節胰島素信號通路，TNF 信號通路、NF-κB 信號通路、PPAR 信號通路等多條途徑，發揮改善胰島素抵抗，抑制炎癥反應，調節脂質代謝、抗氧化應激等作用來防治動脈粥樣硬化。該研究從整體水平，預測和分析了生脈散治療動脈粥樣硬化的作用機制，對于后續研究提供了很好的指導。