基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎的關(guān)鍵成分及協(xié)同作用機制

倪清華，李春暉，楊具潔，李 強，孫繼佳，都廣禮，董志穎

（上海中醫(yī)藥大學，上海 201203）

支氣管炎是由生物或非生物因素引起的支氣管黏膜及其周圍組織的急性或慢性特異性炎癥，表現(xiàn)為咳嗽、咳痰不適等癥狀［1］。支氣管炎發(fā)病周期長，易反復(fù)而遷延不愈，誘發(fā)的因素主要有兩方面：一是氣溫下降、病毒感染、空氣污染及過敏等外部因素影響機體；二是由呼吸道防御系統(tǒng)及免疫功能降低等內(nèi)部因素引起［2］。目前在治療上以抗菌、抗炎、抗病毒為主，常用到的西藥有阿莫西林、頭孢氨芐、美喘清等［3］。近年來，我國支氣管炎患者數(shù)目不斷增加，發(fā)病率逐漸上升，不少患者因治療不及時，由慢性支氣管炎發(fā)展為慢性阻塞性肺疾病，嚴重影響身體健康和生活質(zhì)量。

支氣管炎在中醫(yī)學上屬于“咳嗽”“喘證”“痰飲”的范疇，中藥復(fù)方在治療咳喘、支氣管炎等肺部疾病方面有著幾千年的治療經(jīng)驗，一些中成藥制劑已廣泛用于不同類型的支氣管炎疾病治療［4-7］。麻黃湯是辛溫解表的經(jīng)典名方，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘的功效。此方由麻黃、桂枝、甘草、杏仁四味藥組成，其中，麻黃發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫，桂枝發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽化氣。現(xiàn)代藥理學研究表明，麻黃的主要成分具有平喘、抗病毒及免疫抑制等多種作用［8］，桂枝中的桂皮醛、桂皮酸等化學成分具有抗菌、抗炎、抗病毒等藥理作用［9］。麻黃湯中麻黃與桂枝是方劑配伍中常用的藥對，經(jīng)辯證處方，兩者相伍用藥，在治療支氣管炎方面起到了關(guān)鍵作用［10-12］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學利用生物學網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)選取特定信號，展現(xiàn)藥物分子、靶點、通路以及疾病基因之間的關(guān)系，從而預(yù)測藥物成分的作用通路及機制［13］。本文嘗試運用網(wǎng)絡(luò)藥理學、最小集合覆蓋算法以及網(wǎng)絡(luò)擾動分析方法，篩選麻黃與桂枝配伍治療支氣管炎的主要活性成分，預(yù)測其作用靶點，構(gòu)建成分-組合-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，挖掘起協(xié)同治療的組合成分，進一步探討兩藥相伍治療支氣管炎的作用機制；同時，創(chuàng)新性地提出通過最小集合覆蓋算法與網(wǎng)絡(luò)擾動分析方法來挖掘藥對中的核心成分以及發(fā)現(xiàn)藥對中不同成分的協(xié)同治療效應(yīng)。

1 方法

1.1 成分數(shù)據(jù)的收集與ADMET 篩選 通過TCMSP（http：／ ／tcmspw.com／tcmsp.php ）［14］收集，收集麻黃（Ephedra Herba）和桂枝（Cinnamomi Ramulus）的主要化學成分，根據(jù)PubChem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫［15-16］進行確認并收集每種成分的PubChem ID以及Canonical SMILES 等信息，以此建立麻黃-桂枝的化學成分數(shù)據(jù)庫。利用ACD／Labs 軟件［17］，以Lipinski［18］、Solubility、Bioavailability、Metabolic Stability、Ames、hERG 為指標，對麻黃和桂枝的成分進行ADMET 篩選。其中，Lipinski 類藥五規(guī)則是篩選類藥分子的基本法則，在篩選時除去評價為“Bad”的成分；Solubility 為化合物溶解性指標，在篩選時除去“Highly insoluble”的成分；Bioavailability 為口服利用度預(yù)測，一般取其值高于90%（Dose 參數(shù)取mg ＝50）的化合物作為有效成分；Metabolic Stability 是衡量藥物代謝穩(wěn)定性的指標，在ADMET 評價中，除去“Unstable in HLM”；Ames 和hERG 分別是基因毒性和心臟毒性指標，篩選時去除具有明確毒性的成分。

1.2 有效成分的靶點預(yù)測與識別 利用SEA（http：／ ／sea.bkslab.org／）［19］和 HitPick（http：／ ／mips.helmholtzmuenchen.de／proj／hitpick）［20］數(shù)據(jù)庫進行靶點預(yù)測。參數(shù)設(shè)置如下：Max Tc ＞0.6，Precision ＞50%。在DisGeNET（http：／ ／disgenet.org／home／）［21］、GeneCards（https：／ ／www.genecards.org／）［22］和 OMIM（https：／ ／omim.org／）［23］數(shù)據(jù)庫中收集與“Bronchitis”（支氣管炎）相關(guān)的基因。運用Venny2.1.0 在線系統(tǒng)（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html），將3 個數(shù)據(jù)庫收集到的相關(guān)支氣管炎的基因與麻黃、桂枝有效成分的作用靶點通過取交集進行靶點識別，識別出的所有靶點再通過UniProt（https：／ ／www.uniprot.org／）［24］數(shù)據(jù)庫進一步確認。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析 將上述靶點導(dǎo)入STRING（https：／ ／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置Organism 參數(shù)為Homo Sapiens，將Combine Score 閾值取為0.7。采用Gephi0.9.2 軟件構(gòu)建靶點蛋白的PPI 網(wǎng)絡(luò)并進行分析，通過Cytoscape 3.7.1 中的MODE 工具對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行模塊挖掘，搜索PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心子模塊。

1.4 靶點GO 功能與KEGG 通路富集分析 采用DAVID 6.8（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）［25］對靶點蛋白進行GO功能與KEGG 通路富集分析，根據(jù)Pvalue ＜0.05、FDR＜0.05 進行篩選。根據(jù)KEGG 通路富集分析結(jié)果建立數(shù)據(jù)文件，利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基于SCP 算法的麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎的關(guān)鍵成分挖掘 最小集合覆蓋問題（set covering problem，SCP）是組合優(yōu)化和理論計算科學中的一類典型問題，它要求以最小代價將某個集合利用其若干子集合加以覆蓋［26］，已被證明是一個NP 最優(yōu)化組合問題，不存在多項式時間精確算法，在實際應(yīng)用中往往只設(shè)計求解近似算法，如貪心算法求得近似最優(yōu)解。因此，本文利用基于貪心思想［27］的SCP 算法，可從已知成分-靶點作用關(guān)系中找到包含所有靶點、數(shù)量最少的麻黃與桂枝有效成分的集合，這些有效成分作用了與原來組分完全相同的靶點，可認為這個最小有效成分集合就是麻黃與桂枝配伍治療支氣管炎的核心組分，即關(guān)鍵成分集合。

1.6 基于PPI 網(wǎng)絡(luò)擾動的藥對關(guān)鍵成分的協(xié)同性分析 藥物的靶點網(wǎng)絡(luò)特征是指在人類蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)背景下，藥物靶點蛋白之間所具有的網(wǎng)絡(luò)特征。平均最短路徑距離就是最常見的衡量特征之一，即在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，藥物作用靶點之間所具有的最少節(jié)點個數(shù)。根據(jù)藥物靶點之間的最短路徑距離，可以體現(xiàn)藥物靶點對疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的擾動大小，進一步衡量藥物對疾病的治療效果。因此，利用關(guān)鍵成分集CMG作用的靶點在“1.3”項下PPI 網(wǎng)絡(luò)上的平均最短路徑來計算麻黃與桂枝關(guān)鍵成分之間的不同組合對疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)的擾動程度，從而衡量兩味中藥中關(guān)鍵成分的協(xié)同組合治療特性，以及對支氣管炎PPI 網(wǎng)絡(luò)的擾動程度。具體如下。

其中，dA∈CMG為麻黃中的關(guān)鍵成分，dB∈CMG為桂枝中的關(guān)鍵成分；S（dA，dB）為成分dA與成分dB作用靶點的平均最短路徑；nA為成分麻黃dA的靶點個數(shù)，nB為桂枝dB的靶點個數(shù)。S（dA，dB）越大，表明2 種藥物的成分組合對該疾病網(wǎng)絡(luò)的擾動程度越大，即說明這2 種成分組合治療效果越好。

本研究基于貪心思想的SCP 算法以及網(wǎng)絡(luò)擾動計算，均采用課題組使用R 語言（3.6.2）開發(fā)的軟件工具包完成。

1.7 分子對接驗證 采用分子對接技術(shù)，對PPI 網(wǎng)絡(luò)中Degree 值≥20 的核心靶點進行分子對接驗證。從PubChem和PDB 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.rcsb.org／）中下載靶點蛋白的pdb 結(jié)構(gòu)文件，利用PyMOL 軟件（https：／ ／pymol.org／）對所有小分子和關(guān)鍵靶點蛋白進行預(yù)處理，去除水分子等雜質(zhì)，將靶點蛋白輸入POCASA 1.1 系統(tǒng)（http：／ ／altair.sci.hokudai.ac.jp／g6／service／pocasa／）［28］并計算每個蛋白配體的最佳結(jié)合位點（區(qū)域），運用AutoDock Vina軟件（http：／ ／vina.scripps.edu／）［29］進行半柔性分子對接，計算所有小分子與其作用靶點的親和力值affinity。

2 結(jié)果

2.1 麻黃-桂枝藥對有效成分的ADMET 篩選 經(jīng)ACD／Labs 軟件篩選，總計得到310 種麻黃、桂枝中的有效成分，去除兩者相同成分，最終納入266 種類藥性較好的有效成分。

2.2 疾病靶點的數(shù)據(jù)收集與靶點識別 通過對266 種有效成分進行靶點預(yù)測、篩選與整理，總共得到1 640 對成分-靶點作用關(guān)系，經(jīng)進一步篩選，得到202 個有效成分以及315 個與成分相對應(yīng)的潛在作用靶點。從DisGeNET、Gene-Cards、OMIM 數(shù)據(jù)庫中分別查詢得到65、1 036、52 個與支氣管炎相關(guān)的疾病基因，經(jīng)Venny2.1.0 在線系統(tǒng)的靶點識別，結(jié)果如圖1 所示。通過取交集，得到麻黃與桂枝配伍抗支氣管炎的110 個主要成分以及對應(yīng)的85 個作用靶點，所有靶點通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行確認，結(jié)果如表1 所示。

圖1 麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎預(yù)測作用靶點識別

表1 麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎的85 個潛在作用靶點

續(xù)表1

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析 將上述85 個作用靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫后得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，如圖2 所示，每個靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)中的度值（Degree）如圖3 所示。由此可知，VEGFA、STAT3、PIK3R1、EGFR、AKT1、MMP9、SRC 等靶點蛋白度值較大（Degree≥20），表明這些靶蛋白與其他蛋白相互調(diào)控作用較強，是PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點集，也可稱為Hub 節(jié)點集。

圖2 麻黃-桂枝作用靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值（Degree）分布

通過MCODE 分析，選取Score＞5.0 的子模塊，得到2個高度連接的子網(wǎng)絡(luò)，如表2、圖4 所示，表明這些靶點蛋白調(diào)控的模塊可能在治療支氣管炎的過程中起到重要作用。

2.4 靶點GO 功能與KEGG Pathway 富集分析 在DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫中，對85 個靶點進行GO 功能（BP、CC、MF）、KEGG 信號通路篩選。GO 功能富集共得到33 個結(jié)果，其中生物過程（Biological Process，BP）有17 個，細胞定位（cellular component，CC）有2 個，分子功能（molecular function，MF）有14 個，主要涉及氧化還原過程、正向調(diào)控細胞增殖、細胞外區(qū)域、細胞器膜、ATP 結(jié)合以及血紅素結(jié)合等，如圖5 所示。

表2 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心子模塊及靶點集

圖4 核心子模塊及靶點蛋白

KEGG Pathway 富集分析得到18 個相關(guān)信號通路，結(jié)果如圖6 所示，表明麻黃與桂枝配伍用藥的有效成分主要通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt、TNF、HIF-1、VEGF 等信號通路來治療支氣管炎。具體作用靶點-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如圖7 所示。

圖5 麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎作用靶點的GO 功能富集分析

2.5 關(guān)鍵成分挖掘及協(xié)同組合分析 利用基于貪心思想的SCP 算法，對麻黃、桂枝配伍治療支氣管炎的440 個成分-靶點作用關(guān)系進行計算，優(yōu)化得到覆蓋全部85 個靶點的22 個關(guān)鍵成分。其中，麻黃有11 種成分，桂枝有7 種成分，且兩藥存在4 種共有成分，如表3 所示。

圖6 麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎作用靶點的KEGG Pathway 富集分析

圖7 麻黃-桂枝藥對治療支氣管炎的靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

表3 基于貪心思想SCP 計算的麻黃-桂枝藥對關(guān)鍵成分

采用“1.6”項下方法，對優(yōu)化得到的22 個關(guān)鍵成分進行PPI 網(wǎng)絡(luò)擾動分析，計算麻黃與桂枝不同成分之間的協(xié)同性評分值，以此探測不同成分之間可能存在的組合治療效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)麻黃中的7 種成分與桂枝中的6 種成分之間存在42 對潛在協(xié)同治療組合，具體協(xié)同評分值如圖8所示。由此可知，麻黃中isobutyraldehyde（MOL003416）、3-methyl-2-butanone（MOL005727）與桂枝中1，2-dibenzoylethane（MOL010555）、benzyl benzoate（MOL003032）、4-ethyl-2-methoxyphenol（MOL002334）之間具有較高協(xié)同評分值，提示這些成分相互組合對PPI 網(wǎng)絡(luò)的擾動程度較大，在治療疾病的過程中可能通過這些成分組合之間的協(xié)同作用，促使麻黃、桂枝藥對產(chǎn)生比簡單藥效疊加更大的潛在治療作用。

圖8 麻黃、桂枝中42 對核心成分協(xié)同評分值

再以Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“成分-協(xié)同-靶點”作用網(wǎng)絡(luò)，如圖9 所示。

圖9 關(guān)鍵成分-協(xié)同-靶點作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接驗證 通過分子對接驗證發(fā)現(xiàn)，麻黃、桂枝兩藥中的5 個有效成分2-Methoxybenzaldehyde、2-Methoxybenzoic acid、Apigenin、Luteolin、Quercetin 與7 個核心靶點（Hub 節(jié)點）均具有較好的親和力值（affinity），說明這些有效成分能夠通過調(diào)節(jié)這些核心靶點來治療或改善支氣管炎，如表4 所示。

3 討論

本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學研究和分析的基礎(chǔ)上，引入基于貪心思想的最小集合覆蓋（SCP）算法，挖掘麻黃與桂枝配伍入藥治療支氣管炎的核心成分組合。利用基于平均最短路徑的網(wǎng)絡(luò)擾動分析方法，探測麻黃與桂枝兩味中藥中的關(guān)鍵成分組合在治療支氣管炎中的協(xié)同作用。

利用AutoDock vina 軟件對麻黃、桂枝兩味中藥中5 種關(guān)鍵有效成分（luteolin、apigenin、quercetin、2-methoxybenzaldehyde、2-methoxybenzoic acid）所作用的7 個核心靶點進行分子對接驗證。木犀草素（luteolin）是一種包含多種藥理活性的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗過敏、抗氧化等特性［30］。研究證實［31-33］，木犀草素主要通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)來起到緩解炎癥的作用，能夠抑制與引發(fā)疾病相關(guān)的炎癥因子TNF-α、LTB4 的生成，以及抑制NF-κB、組胺、轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 等的表達來緩解支氣管炎癥。芹菜素被稱為“植物雌激素”，藥用價值極高，闞偉娟［34］等在芹菜素（apigenin）抗炎機制的研究中發(fā)現(xiàn)，芹菜素通過下調(diào)iNOS 蛋白表達水平，能顯著抑制巨噬細胞對炎癥因子TNF-α、IL-6 及炎癥介質(zhì)NO 的釋放。槲皮素（quercetin）為一種具有多種生物學活性的多羥基黃酮類化合物，在抗炎、抗癌、抗氧化等方面均顯示出極高的藥用價值［35］；研究顯示［36］，槲皮素可以通過下調(diào)氣道上皮TLR4／NF-κB 的表達，從而起到緩解支氣管炎癥的作用。

表4 關(guān)鍵成分-靶點分子對接結(jié)果

在PPI 網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘中，我們發(fā)現(xiàn)了麻黃-桂枝藥對作用的2 個核心子模塊，并對其85 個作用靶點進行了GO 功能和KEGG Pathway 富集分析，結(jié)果顯示麻黃與桂枝兩味中藥配伍使用涉及33 個GO 功能以及18 個信號通路。其中，VEGF 靶點及信號通路可直接參與對血管新生的調(diào)控，能明顯促進全身各組織器官血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及趨化［37］。MMP3 能降解細胞外基質(zhì)和基底膜，在炎癥發(fā)生、傷口愈合、組織修復(fù)及重塑中有重要作用，其表達量增加會導(dǎo)致疾病發(fā)生［38］。有研究證明［38-40］，木犀草素可以與MMP3 較好的結(jié)合，故推測木犀草素是通過下調(diào)MMP3 的表達量來緩解炎癥反應(yīng)。MMP9 通過降解內(nèi)皮基底膜的Ⅳ型膠原成分，從而降低內(nèi)皮的屏障功能，引發(fā)炎癥。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）通過激活p38 MAPK 信號通路發(fā)揮緩解支氣管炎癥的作用。有研究證明［41-42］，MAPK 抑制劑可能是治療支氣管炎癥的關(guān)鍵靶點，對揭示中藥臨床功效有實際意義。PI3K-Akt 信號通路受PTEN、CTMP、SHIP2等多種因子調(diào)節(jié)，是細胞生存的重要通路之一。研究顯示［43-45］，PI3K／Akt 可能通過靶向下調(diào)CD38 的表達，從而加速細胞周期、促進氣道平滑肌的增殖。HIF-1 信號通路可在低氧環(huán)境下激活細胞中多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，存在HIF-1 的巨噬細胞能抑制炎性細胞因子，往往表現(xiàn)出較好的吞噬能力和遷移能力［46-47］。

通過SCP 算法，優(yōu)化得到麻黃、桂枝的22 個關(guān)鍵成分，結(jié)合基于平均最短路徑的網(wǎng)絡(luò)擾動分析方法，從定量分析角度研究兩藥中關(guān)鍵成分的內(nèi)在協(xié)同機制，預(yù)測出麻黃中7 個成分與桂枝的6 個成分之間相互組合具有潛在協(xié)同效應(yīng)，猜測兩味中藥相伍使用在治療支氣管炎過程中，可能通過這些成分之間的組合效應(yīng)，產(chǎn)生了比簡單藥效疊加更大的潛在協(xié)同治療作用。

綜上所述，麻黃湯中的麻黃與桂枝配伍用藥在對抗支氣管炎中具有“多成分、多靶點、多途徑”的分子協(xié)同機制和特點，利用本文提出的方法可以有效地從中藥復(fù)方中挖掘核心成分，為深入開展常用中藥藥對的功效機理研究和開發(fā)應(yīng)用建立理論和方法學途徑，為進一步開展中醫(yī)臨床辨證施治、方劑配伍合理用藥的深入研究和開發(fā)利用提供理論和方法學上的參考。